摘要
背景目的: 骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是导致肢体功能障碍和残疾的原因之一，主要由老龄、肥胖、创伤等多种因素诱发。随着老龄化程度的加深以及肥胖人口数量的增加，OA发病率在日益升高。细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的机制，参与机体众多的生理和病理过程，在OA中起着重要作用。壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)是一种低聚糖，已发现其具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用，且不同结构类型的COS生物学活性不同，然而目前COS对软骨细胞以及OA的作用研究尚少。 本课题的主要目的是探讨不同脱乙酰度COS对炎症状态下软骨细胞、软骨组织的影响以及不同脱乙酰度COS调控软骨细胞自噬的作用机制。 方法材料: 1.明确不同脱乙酰度的COS对软骨细胞的保护作用以及筛选对软骨细胞保护作用最佳的COS类型。收集人股骨头表面软骨标本，提取并培养软骨细胞，通过甲苯胺蓝染色、番红-O染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色等方法鉴定软骨细胞;利用IL-1β刺激软骨细胞建立OA细胞模型;利用CCK-8法测量不同脱乙酰度COS对正常软骨细胞和炎性模型软骨细胞活性的影响;用流式细胞仪检测在不同脱乙酰度COS干预下软骨细胞的凋亡水平;收集软骨细胞，利用RT-PCR 法检测 MMP13,ADAMTS-5,COL2A1,ACAN 基因的表达水平;Western blot法检测MMP13,ADAMTS-5,COL2，ACAN蛋白表达量，筛选出对软骨细胞保护作用最佳的COS类型。 2.体内验证COS对OA的作用。用前交叉韧带切除+内侧半月板切除术的方法建立Sprague-Dawley(SD)大鼠OA模型;实验组给予大鼠COS灌胃处理，4周后处死大鼠，利用RT-PCR法检测Mmp13,Col2a1基因的表达水平，Western blot法检测MMP13,COL2蛋白的表达水平;苏木素-伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红-O固绿染色以及MMP13,Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色观察SD大鼠软骨改变;Micro-CT扫描观察大鼠软骨下骨改变。 3.检测COS对软骨细胞自噬的影响及机制。建立OA细胞模型，RT-PCR检测Beclin-1基因表达量;Western blot 法 Beclin-1，LC3Ⅰ,LC3Ⅱ 的蛋白表达量;透射电镜观察细胞内自噬小体数量;筛选对软骨细胞自噬水平影响最大的COS类型;通过Western blot法检测软骨细胞在IL-1β、COS、自噬抑制剂(3-MA)等不同干预条件下自噬通路中mTOR,p-mTOR,AMPK,p-AMPK蛋白，AKT,p-AKT蛋白的表达量。 结果: 1.IL-1β能显著抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，提高软骨细胞基质主要降解基因MMP13,ADAMTS-5的表达，同时抑制软骨基质基因COL2A,ACAN的表达;不同脱乙酰度COS对IL-1β诱导的炎症状态下的软骨细胞有一定的保护作用，低脱乙酰度的壳寡糖(Low deacetylation degree chitosan oligosaccharide,LDACOS)的保护作用最明显，能提高软骨细胞增殖活性，降低软骨细胞凋亡水平，改善IL-1β所引起的软骨基质主要成分的降解。 2.SD大鼠OA模型在第4周时关节炎明显出现，RT-PCR显示OA组SD大鼠Mmp13表达明显升高，Col2a1表达降低，LDACOS能减少Mmp13基因的表达，同时提高Col2a1基因的表达;Western blot结果提示OA组SD大鼠MMP13蛋白表达明显升高，COL2蛋白表达降低，LDACOS能调节MMP13,COL2蛋白的表达;苏木素-伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红-O固绿染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色以及Micro-CT扫描结果提示LDSCOS能减轻OA的严重程度，对软骨具有一定的保护作用。 3.COS对软骨细胞自噬起到诱导作用，LDACOS促进Beclin-1基因表达作用最明显，能提高Beclin-1蛋白的表达和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，同时促进软骨细胞自噬小体的形成;LDACOS促进软骨细胞自噬水平的机制可能是通过调控AKT-mTOR信号通路实现。 结论: 本实验明确了 COS对软骨细胞的保护作用及其影响软骨细胞自噬的初步机制。 1.COS在一定程度上能提高炎症状态下软骨细胞活性，减少细胞的凋亡,对软骨细胞具有一定的保护作用，其中LDACOS的保护作用最明显; 2.LDACOS能减少SD大鼠OA模型软骨基质降解，促进软骨基质生成; 3.不同脱乙酰度的COS可以影响软骨细胞的自噬水平，其中LDACOS能显著提高软骨细胞的自噬水平，其机制可能是通过调控AKT-mTOR信号通路实现的。
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