摘要
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一种人畜共患病原体，可感染人及所有家畜家禽，也可感染老虎、黑猩猩等多种野生动物，能引起禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、猪牛羊肺炎及出血性败血症等多种疾病，给养殖业带来了巨大的经济损失。根据其荚膜抗原分型，Pm可以分为A、B、D、E、F五种血清型，在我国牛群中流行的主要为荚膜A型和B型Pm,但目前我国尚无自主研发的针对荚膜A型Pm的商品疫苗，所有相关疫苗均为进口疫苗，且其免疫保护效果并不理想，因此研发更为有效的广谱性Pm疫苗是防控Pm病的关键。 国内外众多学者研究发现，Cpx双组份调控系统对于包括巴氏杆菌科的胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌在内的多数革兰阴性病原体的毒力、耐药性、响应环境刺激等众多方面具有显著影响，而且沙门菌Cpx系统基因缺失菌株还具有作为减毒活疫苗的潜力，因此思考Pm中的Cpx系统基因缺失是否同样能够赋予菌株类似的特性，为此，本论文利用实验室前期从牛场中分离得到的一株强毒力的A型PmCQ2株(PmCQ2)，通过同源重组的方法，构建其Cpx系统基因缺失株，探究cpxA/R基因缺失对菌株相关特性的影响。研究结果如下: 1.△cpxA和△cpxA△cpxR的构建及其部分生物学特性测定 采用同源重组的方法，利用实验室前期改造的多杀性巴氏杆菌基因缺失株构建载体，分别构建了 △cpxA和△cpxA△cpxR,并从基因和转录水平验证了 △cpxA和△cpxA△cpxR的成功构建。体内外连续培养发现，△cpxA和△cpxA△cpxR均可以在体内外稳定遗传。 通过对PmCQ2、△cpxA和△cpxA△cpxR生物学特性的比较分析发现，与PmCQ2相比，△cpxA和△cpxA△cpxR在菌液离心状态、生物膜含量、生化特性、抗生素敏感性、不同培养条件下的生长曲线方面均无显著变化，但其荚膜含量显著降低。 2.△cpxA和△cpxA△cpxR的致病性分析 分别以4×105 CFU PmCQ2、△cpxA和△cpxA△cpxR肌肉途径感染KM小鼠，每天观察，连续7天，小鼠濒死时实施安乐死，记录死亡数，其后测定肌肉感染12 h后肺脏、肝脏、脾脏的细菌定殖量，同时以MTT法测定了 1MOI细菌对小鼠肺泡上皮细胞的毒性，并且参考相关文献进行了部分毒力因子差异表达量的分析，结果发现，与PmCQ2相比，△cpxA、△cpxA△cpxR毒力无显著变化。细胞感染检测试验发现，与野生株感染相比，△cpxA感染小鼠腹腔巨噬细胞，其TNF-α、IL-12p40、IFN-γ等相关炎性因子分泌量显著降低，而△cpxA△cpxR感染仅IL-12p40分泌量显著降低。 3.△cpxA和△cpxA△cpxR灭活苗的交叉免疫保护性评价 为探究cpxA/R基因缺失是否会赋予牛源A型Pm交叉免疫保护能力，本试验制备了 △cpxA、△cpxA△cpxR灭活苗和PBS乳化剂免疫小鼠，首免14 d后加强免疫一次，首免21 d后进行尾静脉采血，检测血清中特异性抗体水平，其后分别采用牛源A型、B型、F型、禽源A型和猪源A型Pm进行攻毒测试。结果发现，两种灭活苗均能诱导小鼠产生针对不同类型抗原的较高水平抗体，但相较于牛源Pm,针对猪源、禽源A型Pm的抗体水平偏低。与实验室前期研究的PmCQ2灭活苗（仅为牛源A型Pm的攻击提供保护作用）相比，两种缺失株灭活苗为牛源A型Pm的攻击提供了 100％的保护，为牛源B型、F型Pm的攻击提供了 50％的保护，对猪源、禽源A型Pm的攻击不提供保护。对两种缺失株灭活苗针对牛源A型抗原的血清抗体消长规律进行测定发现，灭活苗免疫小鼠后，小鼠血清抗体效价连续150 d均维持在1∶25600～1∶102400。 4.△cpxA和△cpxA△cpxR抵抗环境应激能力的研究 为进一步探究cpxA/R基因缺失对于牛源A型Pm环境响应能力的影响，本试验通过在细菌培养过程中改变温度、pH及添加多种刺激因子，模拟高渗透压（高盐和高糖）、酸碱、温度、氧化和金属离子等应激环境，对PmCQ2、△cpxA和△cpxA△cpxR的生存能力进行了测试，同时，通过在培养基中添加硫酸鱼精蛋白，测试了 3株细菌的抗菌肽敏感性。结果发现，在高盐、酸应激和高温应激环境下，△cpxA和△cpxA△cpxR的生长速度显著快于PmCQ2;而△cpxA在30℃下生长慢于PmCQ2,△cpxA△cpxR在pH为8.5时生长慢于△cpxA;两种基因缺失株对抗高糖、氧化应激、金属离子应激的能力和抗菌肽敏感性，与PmCQ2相比均无显著变化。以上结果提示，Cpx调控系统基因对于PmCQ2应对部分环境应激能力的影响是多方面的。
NETL