摘要
大豆(Glycine max L.）是世界上重要的油料作物，为人类提供了丰富的蛋白质和油脂。大豆作为喜温作物，在生长早期幼苗对低温胁迫的响应十分敏感。低温不仅严重制约了作物的生长发育，也影响了作物的种植。因此如何提高作物的抗寒性一直是育种家们努力达到的目标之一。本研究用人工气候培养箱模拟低温环境，对来自于不同生态区的188份大豆品种进行苗期抗寒性表型鉴定。同时，利用GWAS技术挖掘抗寒相关的SNP位点，并结合RNA-seq数据进一步筛选到了抗寒相关的候选基因GmCBF4,并且对该基因进行了初步的功能验证，本研究为大豆抗寒分子育种提供理论基础。本研究取得的主要结果如下: 1.大豆苗期抗寒性表型鉴定。本研究以188份自然群体大豆为研究对象，以4℃低温进行大豆苗期抗寒性鉴定，同时设置22℃正常温度下生长的大豆为对照，通过对各个品种的叶绿素荧光参数:qL（光化学猝灭系数）、Fv/Fm（PSⅡ的最大量子效率）、NPQ（非光化学猝灭值）、SPAD（叶绿素含量）及LI（叶片损伤指数）等指标的方差分析和相关性分析及耐冷指数评价，确立了以qL（光化学猝灭系数）、Fv/Fm（PSⅡ的最大量子效率）、NPQ（非光化学猝灭值）、SPAD（叶绿素含量）、LI（叶片损伤指数）及LT（叶片厚度）这6个参数为指标的抗寒性鉴定方法。并通过此鉴定方法对188份大豆品种进行抗寒性表型鉴定，通过表型观察和数据分析，筛选出6份强抗寒品种和8份极敏感型品种，为大豆抗寒育种和机理等方面的研究提供材料基础。 2.全基因组关联分析挖掘大豆抗寒候选基因。结合188份大豆品种的抗寒性表型数据与高通量重测序数据，通过GWAS技术筛选抗寒的关键候选基因。关联分析表明:在第4、10、12、15和16号染色体上共有25个与大豆抗寒性显著相关的SNP位点。通过基因注释信息筛选关联分析得到的142个候选基因，其中GLYMA 9900、GLYMA_16G199000、GLYMA_12G196200、GLYMA_10G103000、GLYMA_04 G055300、GLYMA_12G195500、GLYMA_12G195700与氧化还原酶活性、叶绿素合成、细胞结构等有关。 3.大豆抗寒和敏感材料的RNA-seq分析。为了缩小候选基因的范围，将其中一份抗寒品种（V100）和一份敏感品种（V45）在4℃条件下处理，分别在0h、6h和12h取样并进行转录组测序分析。分别分析抗寒材料和敏感材料受到低温胁迫后的差异表达基因:抗寒品种，0h与6h处理材料相比，存在3258个差异表达的基因，其中，上调表达基因2296个，下调表达基因962个，0h与12h处理下相比，共检测到6830个差异表达基因，其中上调表达基因有4149个，下调表达基因2681个;敏感品种，0h与6h冷胁迫处理相比，共检测到4015个基因，其中，上调表达的基因有2658个，下调表达基因有1357个。0h与12h冷胁迫下处理相比，共检测到6446个差异表达基因，其中，上调表达的基因有3994个，下调表达基因有2452个。进一步分析发现GWAS挖掘到的142个候选基因中有5个在抗寒和敏感材料受冷胁迫后上调表达，其中GmCBF4所属的CBF基因家族在其他植物上的抗寒功能已被广泛报道，所以本研究选取GmCBF4作为研究对象。 4.大豆抗寒相关基因GmCBF4的基因功能初步验证。本研究构建了 GmCBF4的过表达载体，并通过农杆菌介导的浸花法在拟南芥中进行了大豆GmCBF4基因的异源表达，通过PCR验证异源表达株系，并在T2代进行耐低温表型鉴定，结果表型异源表达大豆GmCBF4基因的拟南芥株系在-4℃低温下表现出极强的耐寒性，说明GmCBF4是一个促进大豆耐寒的基因。
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