摘要
心肌梗死(myocardial infarction,MI)后，为维持心脏结构完整以及收缩功能，以成纤维细胞为主的修复性细胞分泌大量富含Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen Ⅰ、Ⅲ，ColⅠ、Ⅲ)的细胞外基质(extracellular matrix,ECM),但胶原蛋白的过度分泌最终导致心肌纤维化，严重影响患者预后。因此，调节ECM蛋白的表达，调控心肌纤维化进程是改善MI患者预后关键因素之一，但目前心肌纤维化的发生机制尚不明确。C 反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)是重要的转录调节因子，MI后主要通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin angiotensin aldosterone system,RAAS)被激活，而 RASS 系统的激活与 ECM 蛋白的表达呈正相关，那么，CREB是否直接参与MI后心肌纤维化进程？是否调节ECM蛋白的表达？尚有待研究。 在MI后，心肌组织大量炎细胞浸润，同时，活性氧(reactive oxide species,ROS)水平升高，心肌组织氧化还原失衡。而氧化还原状态的改变除了能够促进细胞的坏死和凋亡外，由此引发的蛋白质翻译后修饰异常也是引起或者加重组织损伤不可忽略的重要机制。由于MI后心肌组织局部一氧化氮(nitric oxide,NO)水平升高，在ROS的作用下，过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anion,ONOO-)水平升高，最终使蛋白质发生硝基化修饰。蛋白质的硝基化作为一种翻译后修饰，能够影响其功能。CREB可能是参与心肌纤维化的关键转录因子。那么，CREB能否发生硝基化修饰？如果可以，硝基化修饰是否影响CREB的转录活性？还未见报道。 本研究利用Sprague Dawley(SD)大鼠MI模型及体外原代大鼠CFs培养，运用心脏功能、形态学检测技术，结合蛋白质免疫印迹以及染色质免疫共沉淀检测等分子生物学方法，旨在:①明确CREB在MI后心肌纤维化中的作用;②探究CREB调节ECM蛋白表达的机制;③探究硝基化通过促进CREB的转录活性进而参与MI后心肌纤维化过程的分子机制。 我们的研究表明，首先，SD大鼠MI模型中心肌CREB水平升高，ECM蛋白水平升高，提示CREB可能与ECM蛋白的表达存在相关性。在细胞和大体水平逆转CREB表达后，ECM蛋白水平下降，提示其参与MI后ECM的合成和分泌过程。细胞实验也表明CREB促进CFs的增殖和迁移。其次，根据《Rubbins BASIC PATHOLOGY》中MI后的心肌组织病理变化，将SD大鼠分为梗死后0、1、3、7、10、14、30、60和90天组，结果显示，CREB在MI后14天时出现高表达，与ECM蛋白的高表达时间基本相同，提示CREB在MI后增生期参与ECM蛋白分泌的调节。利用RNA-seq和ChIP-seq对CREB下游基因进行筛查并通过western blot以及RT-qPCR进行验证，我们发现，CREB能够通过上调骨膜蛋白(periostin)促进ECM蛋白的高表达。同时，CREB直接参与ECM蛋白中col1a2以及cxcl12 mRNA的转录。以上结果提示CREB通过调节ECM蛋白的表达促进MI后心肌纤维化的过程。最后，在动物模型中我们发现，MI后心肌组织硝化应激水平升高，提示MI后蛋白质能够发生硝基化修饰。在细胞水平，通过IP实验证实CREB能够发生硝基化修饰，并且确定其硝基化修饰位点为第182、307和336位酪氨酸。在大体和细胞水平，我们的研究表明CREB硝基化修饰通过促进其磷酸化、核易位以及与转录共激活因子TORC2的结合进而促进其对col1a2和cxcl12的转录，参与MI后心肌纤维化的进程。 综上，MI后，心肌组织CREB表达增高，通过调控CFs的增殖、迁移以及ECM蛋白的分泌而参与MI后心肌纤维化的过程。CREB可通过上调periostin的表达促进ECM蛋白的分泌。同时，磷酸化CREB入核后，通过直接诱导col1a2以及cxcl12的转录促进ECM蛋白的分泌。在此过程中，CREB的硝基化修饰通过增强其磷酸化、核易位以及与辅助因子的结合进而加速MI后心肌纤维化进程。 本研究探究转录因子CREB在MI后心肌纤维化中的作用及相关机制。从新的角度阐释心肌纤维化的分子机制，探究基于蛋白质硝基化修饰的疗法在防治MI后心肌纤维化过程中的可能性。本研究丰富了对MI后心肌纤维化的发生机制的认识，为临床心肌纤维化的检测和治疗提供新的思路和干预靶点。
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