摘要
油菜是世界上重要的油料作物之一，也是我国主要的油料作物。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是当前主要的油菜栽培类型，其具有油用、饲用等多种用途，具备极高的价值，发展前景广阔。但甘蓝型油菜的整个生长发育期需水量大，对干旱胁迫的适应性较差，干旱胁迫会影响其生长发育，降低产量。而我国又是干旱多发的国家，油菜的主要种植区也多处于干旱或半干旱地区。因此，提高甘蓝型油菜的抗旱能力，培育抗旱品种对促进油菜产业高质量发展具有重要意义。 本课题组前期利用248份甘蓝型油菜种质资源基于60K芯片SNP位点多态性进行全基因组关联分析，获得了耐旱候选基因BnaC03.ATAF2。本研究在此基础上做进一步的功能验证。 首先对甘蓝(Brassica oleracea L.）、白菜型油菜(Brassica rapa L.）、甘蓝型油菜中ATAF家族成员进行全基因组鉴定并探究其中的进化关系，分析拟南芥(Arabidopsis thaliana)与甘蓝型油菜中ATAF家族成员的基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件、蛋白理化性质等。其次，构建BnaC03.ATAF2过表达载体遗传转化拟南芥，比较转基因拟南芥与野生型之间的耐旱性差异。进一步通过酵母双杂交与双分子荧光互补筛选出BnaC03.ATAF2的互作蛋白，最后结合下游干旱胁迫响应基因的表达来推测BnaC03.ATAF2可能结合的下游靶基因，从而为阐明BnaC03.ATAF2的耐旱分子机制提供理论基础。 本研究主要结果如下: 1.ATAF家族生物信息学分析 利用拟南芥中4个ATAF家族成员，通过蛋白序列比对及保守结构域的鉴定分别在甘蓝、白菜型油菜、甘蓝型油菜中鉴定到7个、7个、14个成员，鉴定结果说明甘蓝和白菜型油菜在芸薹属发生染色体组三倍化后ATAF1、NAC032、NAC102的拷贝丢失。对32个ATAF家族成员进行进化关系分析发现，甘蓝型油菜中A染色体上的ATAF家族基因与白菜型油菜中的同源基因亲缘关系最近，而C染色体上的ATAF家族基因与甘蓝中的同源基因亲缘关系最近。 甘蓝型油菜ATAF家族成员理化性质分析结果显示，所有成员蛋白序列长度为252到 294Aa不等，分子量在28.89到33.67kDa之间，蛋白质等电点从5.32到9.11不等。基因结构及保守基序分析结果显示，所有成员外显子数量均为2-3个，并且蛋白N端具有高度保守的4个基序Motif1～Motif4,C端TAR则具有ATAF家族特有保守基序EVQS[E/x]PK[W/I]。 顺式作用元件预测结果显示BnaATAF家族成员启动子区域含有大量与植物激素、胁迫响应相关的元件，表明甘蓝型油菜ATAF家族成员可能参与响应干旱、低温等非生物胁迫及植物激素诱导等过程。 2.BnaC03.ATAF2表达模式分析 对中双11进行苗期自然干旱胁迫、PEG模拟干旱胁迫、盐胁迫、ABA处理，通过qRT-PCR分析发现BnaC03.ATAF2的表达量均显著上升,说明BnaC03.ATAF2可能会受ABA的诱导，参与植物响应非生物胁迫的过程。 构建启动子-GUS表达载体遗传转化拟南芥，进行GUS染色，结果说明BnaC03.ATAF2在拟南芥苗期的各个组织部位均有表达，在蕾薹期和花期的根、幼叶、花和角果中表达。 烟草亚细胞定位结果显示BnaC03.ATAF2蛋白在细胞核中表达。 3.BnaC03.ATAF2耐旱功能验证 构建过表达载体遗传转化拟南芥，在幼苗期进行甘露醇胁迫处理，发现过表达BnaC03.ATAF2能促进拟南芥幼苗的根长伸长，有利于拟南芥吸收水分。 对苗期拟南芥进行离体叶片失水速率测定与干旱胁迫处理，发现过表达株系叶片具有更强的保水能力，并且干旱条件下叶片中能积累更多的脯氨酸(PRO)、可溶性糖(SUG),更少的丙二醛(MDA)。 上述实验结果说明，BnaC03.ATAF2通过调节根系形态、增强叶片保水能力、积累更多的渗透调节物质和降低细胞膜损伤程度来增强转基因拟南芥的耐旱性。 4.BnaC03.ATAF2互作蛋白筛选 通过酵母双杂交实验发现BnaC03.ATAF2具有自激活活性，进一步对BnaC03.ATAF2蛋白进行截短，发现其转录激活域位于C端。酵母双杂筛库得到26个与植物激素信号通路及非生物胁迫相关的潜在互作基因。采用点对点和双分子荧光互补进行验证发现BnaA09.NF-YC9、BnaA03.CAT2与BnaC03.ATAF2存在互作关系。 对过表达株系中ABA信号通路下游干旱胁迫响应基因的表达水平进行检测,发现在正常培养与干旱胁迫下，3个过表达株系中AtRD29A、AtRD29B、AtRAB18的表达水平均极显著高于野生型，结果表明，RD29A、RD29B、RAB18可能是BnaC03.ATAF2与BnaA09.NF-YC9蛋白复合体的下游靶基因。
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