摘要
镰刀菌属是自然界中普遍存在的病原性真菌，感染谷类作物不仅会引起产量损失，还会产生多种霉菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ Deoxynivalenol, DON ）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEA）、雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol, NIV）等，污染谷物原料和饲料，降低营养品质，威胁动物健康，进而危及人类食品安全。因此，解决真菌污染问题，是饲料及食品安全的重要课题。本研究以禾谷镰刀菌为指示菌，首先，通过对峙试验筛选分离出一株可显著抑制其生长的菌株，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌HAU3，并对其安全性进行评价；其次，对该菌抑菌物质分布和性质进行分析，揭示其作用靶点和抑菌机制；进一步通过制备色谱和二维磁共振对抑菌活性物质进行分离鉴定，并使用全基因组测序对可能发挥作用的次级代谢产物生物合成基因簇预测分析；最后，将解淀粉芽孢杆菌作为青贮添加剂，检验其抗真菌的效果，评价其对禾谷镰刀菌感染的全作物小麦青贮饲料的发酵质量及微生物群落的影响，检验其抗真菌的效果。 试验一：禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选鉴定及体外安全性评价 从土壤样本中筛选得到一株可抑制禾谷镰刀菌的菌株HAU3，其抑菌直径可达5.44 mm，结合形态学、16S rDNA测序、生理生化鉴定综合判定其为解淀粉芽孢杆菌，命名为HAU3，在此基础上，对该菌进行安全性评价，结果表明，解淀粉芽孢杆菌HAU3不携带毒力基因bceT、cytK、ces、hblA、nheA，不具有硝酸盐还原酶活性，不具有鸟氨酸、精氨酸、赖氨酸脱羧酶活性，对多种抗生素均敏感。 试验二：解淀粉芽孢杆菌HAU3抑菌活性物质分布及作用靶点分析 通过对解淀粉芽孢杆菌HAU3发挥抑菌作用的活性物质分布部位探究，发现抑菌物质存在于无菌上清液中，20%无菌上清对禾谷镰刀菌的抑菌率可达98.46%。解淀粉芽孢杆菌HAU3在不同的温度、PH、紫外线照射处理，对其抑菌活性影响较小。通过扫描电镜、透射电镜分析，发现解淀粉芽孢杆菌HAU3可靶向作用于真菌菌丝细胞膜，导致细胞膜皱缩、内容物外溢。ROS检测和PI染色可见，禾谷镰刀菌菌丝中活性氧积累，PI染料可以侵入胞内。 试验三：解淀粉芽孢杆菌HAU3抑菌活性物质的鉴定及全基因组测序分析 采用制备色谱和二维核磁对可能的抑菌化合物分离鉴定，结果表明，发挥作用的物质为具有脂环结构的丰原素。通过全基因组测序分析，发现解淀粉芽孢杆菌HAU3为全长4063259 bp的环状染色体，GC含量46.27%，共预测到4246个编码蛋白质的DNA序列，86个tRNA基因， 27个rRNA操纵子。对其基因和蛋白功能注释分析发现，有关代谢途径的基因被显著富集，使用antiSMASH软件对其次级代谢产物基因簇预测分析，发现该菌株共含有13个次级代谢产物基因簇，其中8号可能是参与代谢合成抑菌物质的基因簇。 试验四：解淀粉芽孢杆菌HAU3在青贮中应用评价 以禾谷镰刀菌为指示菌模拟田间真菌感染，评价解淀粉芽孢杆菌HAU3改善真菌侵染对全株小麦青贮品质的不利影响效果。结果表明，无论侵染与否，添加解淀粉芽孢杆菌HAU3均在一定程度上可以改善全株小麦青贮饲料的发酵质量，提升青贮品质，降低了pH、NH3-N水平并提高了DM、CP水平。在细菌属水平上，青贮60 d后，与C组相比，解淀粉芽孢杆菌HAU3能够使乳酸菌相对丰度增加。在真菌属水平上，解淀粉芽孢杆菌HAU3处理使伊萨酵母属（Issatchenkia）相对丰度降低，而假丝酵母（Candida）相对丰度升高。解淀粉芽孢杆菌HAU3处理在一定程度上降低了肠杆菌（Enterobacter）、不动杆菌（Acinetobacter）和木霉菌（Mucor）的相对丰度。
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