摘要
甲型H1N1也称猪流感（Swine influenza, SI），是由A 型流感病毒所引起的一种急性呼吸道传染病，是一种人畜共患病，具有高度传染性和变异性，对公共卫生和经济发展都造成了巨大的负担。鼻腔是流感病毒感染机体的主要部位，如果在鼻腔建立良好的黏膜免疫，则可迅速有效地阻断病毒的感染。鼻内接种灭活疫苗是预防流感病毒感染的有效措施之一，但由于鼻腔纤毛的快速清除及黏膜下树突状细胞(Dendritic cells, DCs)数量不足，单独的灭活疫苗免疫效果并不理想。基于以上问题，设计了一种脂质化MnO2仿生纳米黏膜佐剂（NLipoMn）用于H1N1灭活疫苗（IIV）的鼻内免疫。与单独使用IIV相比，NLipoMn明显延长了IIV的鼻腔滞留时间，提高黏膜上皮细胞分泌趋化因子CCL20的能力，从而促进黏膜下DCs的募集，促进了DCs对IIV的摄取。此外，NLipoMn-IIV中的MNK、MnO2可协同促进DCs成熟， T细胞活化和B细胞成熟，分泌高水平HA特异性IgG及IgA，从而产生强大的黏膜、细胞及体液免疫应答，实现对同源和异源H1N1流感病毒感染的有效保护。具体研究内容如下所示： 1. 纳米佐剂的制备和表征。首先，通过薄膜水合法及超声挤压法合成了NLipoMn。动态光散射（DLS）结果显示NLipoMn的粒径为 246 nm，Zeta 电位为+21 mV。紫外-可见光谱、FT-IR光谱、透射电子显微镜（TEM）图像及能量色散光谱（EDS）图像结果表明MnO2被成功包裹。激光共聚焦显微镜（CLSM）图像、SDS-PAGE及 WB结果表明MNK被成功融合。在吸附 IIV 后，NLipoMn-IIV 的粒径为 350 nm，Zeta 电位为+14 mV，HA 含量为 84.9 μg/mg NLipoMn-IIV。此外，在PBS 或含10% FBS 的 1640培养基中孵育7 天后粒径无明显变化，表明NLipoMn及NLipoMn-IIV具有良好的稳定性。 2. 体外DCs 成熟。使用荧光标记的纳米疫苗与DCs 共孵育，CLSM 图像、流式细胞术与荧光定量结果表明NLipoMn显著提高了DCs对IIV的摄取。此外，NLipoMn-IIV可显著促进BMDCs表面CD80、CD86的表达和相关细胞因子（TNF-α, IL-12, IFN-γ, TNF-α）的分泌。这表明纳米疫苗具有强烈刺激DCs成熟的能力。 3. 黏膜下 DCs 的摄取。使用荧光标记的纳米疫苗分别鼻内接种小鼠观察其鼻腔滞留效果。小动物活体成像和CLSM图像显示NLipoMn可促进IIV在鼻腔黏膜滞留。qPCR和流式细胞术结果表明 NLipoMn可促进趋化因子 CCL20 的分泌来招募 DCs，进而增强 DCs 对IIV的摄取。 4. 纳米疫苗体内免疫效果。对小鼠进行滴鼻免疫后，NLipoMn-IIV 可有效刺激鼻腔组织及脾脏中DCs的成熟，T细胞的活化，B细胞的成熟，诱导产生高滴度的HA特异性IgG及IgA，并且表现出良好的生物安全性。 5. 纳米疫苗体内免疫保护效果。按照先前的免疫程序进行滴鼻免疫后，于初次免疫后第 28 天对小鼠进行流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 (PR8, H1N1)或 A/swine/Zhucheng/90/2014 (ZC14, H1N1)攻毒。监测小鼠体重和存活率，并对攻毒后第 5 天的小鼠肺脏进行肺病理切片观察、肺指数评价及肺部病毒载量测定。结果表明，滴鼻免疫NLipoMn-IIV的小鼠能够有效抵抗同源或异源流感病毒感染，表现为最高的存活率（100%）。 综上所述，本文成功合成了一种脂质化MnO2仿生纳米黏膜佐剂（NLipoMn），NLipoMn-IIV具有良好的体内外安全性，并可促进机体产生强烈的黏膜、体液及细胞免疫应答。在针对同源和异源H1N1流感病毒攻击时，显示出较其他制剂更强的保护效果。本研究为开发流感和其他呼吸道病毒感染的鼻内疫苗提供了一种有前景的、通用的纳米佐剂。
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