摘要
家蚕是以桑叶为食物的寡食性昆虫，然而，目前传统的桑叶养殖模式并不满足现代化产业的发展需求。因此，推动蚕业向现代化集约化发展的人工饲料养殖成为了必然趋势。迄今为止，家蚕人工饲料的研发工作已取得了极大的进展，但由于饲料育家蚕出现生长发育缓慢及抗逆性较差等问题，目前尚未广泛应用于蚕业养殖。因此，克服上述饲料育家蚕面临的困难，利用家蚕人工饲料推进蚕业进行产业转型和技术变革势在必行。 长期以来，家蚕以桑叶为唯一的食物，使其消化系统的生理结构和生长发育的营养需求都与桑叶高度适配。在惯有食物改变后必然会对家蚕机体产生刺激从而引发生理变化。尽管家蚕人工饲料参考了桑叶的成分，但由于成本和实际应用效果，桑叶和人工饲料的营养成分仍存在一定的差异，由此引发桑叶育家蚕和饲料育家蚕体内营养状态和代谢水平的不同。因此，为了促进人工饲料养蚕技术的发展和应用，迫切需要从家蚕对人工饲料的利用和代谢角度，分析探讨人工饲料制约家蚕生长发育的机制，提高家蚕对人工饲料的适应性和代谢利用效率。 本研究主要以桑叶和人工饲料的营养成分差异为基础，从营养代谢角度探究食物改变对家蚕幼虫生长发育的影响。首先，对家蚕幼虫进行食下量实验统计，分析桑叶育家蚕和饲料育家蚕的营养代谢特性;其次，检测桑叶育家蚕和饲料育家蚕血淋巴和脂肪体组织中碳水化合物和脂质物质的含量变化，分析食物改变对家蚕代谢水平的影响;此外，利用RNA-seq测序的方法对两种食物下的家蚕脂肪体组织进行分析，筛选变化显著的代谢通路;基于上述分析，后续验证人工饲料育家蚕机体是否出现氧化应激，探究氧化应激对饲料育家蚕的影响;最后，选取左旋肉碱作为关键物质，探究左旋肉碱在家蚕BmE细胞中的功能，以此验证其是否在人工饲料育家蚕的脂质代谢中发挥作用。主要结果如下: 1、食物改变对家蚕幼虫消化能力的影响 为探究食物改变后对家蚕幼虫消化能力的影响，首先检测了桑叶和人工饲料的营养物质含量，结果显示家蚕人工饲料中碳水化合物含量高于桑叶。同时，对两种食物饲养下的四龄和五龄阶段家蚕幼虫进行食下量统计实验，结果显示，相比于桑叶育家蚕，饲料育家蚕幼虫出现摄食量减少、体重下降、生长发育周期延长的情况。通过对食物营养成分和食下量统计数据的联合分析，结果表明富含高碳水化合物的人工饲料影响家蚕的消化吸收能力，人工饲料育家蚕需要通过调控摄食量和排泄量来调节对于食物中糖类的消化量，避免对身体造成过重的代谢负担。 2、食物改变对家蚕幼虫代谢水平的影响 为深入探究食物中营养成分差异对家蚕代谢水平的影响。我们选取五龄五天桑叶育家蚕和饲料育家蚕的血淋巴和脂肪体组织，检测其中关键碳水化合物和脂质物质的浓度变化。结果显示，相比于桑叶育家蚕，饲料育家蚕血淋巴中的总糖、葡萄糖及海藻糖浓度显著升高，同时，其脂肪体中的葡萄糖和糖原含量也显著增加。此外，饲料育家蚕血淋巴和脂肪体中的游离脂肪浓度也显著升高，但作为贮藏型脂质的甘油三酯含量却显著降低。利用RT-qPCR技术检测糖脂代谢途径相关基因，发现人工饲料育家蚕脂肪体中糖类合成分解以及脂质合成分解代谢相关基因的表达量显著上调。 此外，为宏观分析食物改变对家蚕的影响，我们通过RNA-seq测序的方法对五龄五天桑叶育家蚕和饲料育家蚕脂肪体组织进行转录水平分析。结果显示，共筛选到481个差异表达基因(Differential expressed genes,DEGs),其中包括 229 个上调 DEGs 和 252 个下调 DEGs。DEGs 的 COG(Clusters of orthologous groups,COG)功能分类结果显示，诸多 DEGs 被注释到能量产生和转化、营养物质转运代谢等相关功能。DEGs的GO(Gene Ontology,GO)功能富集结果显示，三羧酸代谢过程、乙酰CoA代谢及氧化还原过程显著上调，单氧酶的活性、ABC转运蛋白复合体及ATP酶依赖性跨膜转运复合物等代谢过程显著下调。DEGs的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集结果显示，丙酮酸代谢、三羧酸循环、糖酵解/糖异生、解毒代谢等代谢过程显著上调，同源重组、寿命调节、果糖和甘露糖等代谢过程显著下调，其中甘油酯代谢同时被富集在上调和下调的代谢通路。上述结果表明，家蚕人工饲料导致家蚕消化吸收到体内的碳水化合物水平更高，从而诱发饲料育家蚕在糖脂代谢水平紊乱。 3、氧化应激对家蚕脂肪体功能的影响 为进一步探讨人工饲料制约家蚕生长发育的机制，通过桑叶育家蚕和饲料育家蚕脂肪体的转录组数据和生化检测的联合分析，结果显示饲料育家蚕可能出现氧化应激状态。随后，活性氧(ROS)水平检测结果显示，相比于桑叶育家蚕，人工饲料育家蚕脂肪体组织ROS水平升高即出现氧化应激。为深入探究氧化应激对家蚕机体的损伤情况，首先通过彗星法DNA损伤检测法对家蚕脂肪体组织进行分析，相比于桑叶育家蚕，饲料育家蚕脂肪体细胞中不仅DNA彗星拖尾现象更为严重，而且出现拖尾状态的彗星DNA数目更多。其次，通过对家蚕脂肪体组织的ATP水平和线粒体辅酶Ⅰ(NAD)的含量进行测定，实验结果显示，相比于桑叶育家蚕，饲料育家蚕脂肪体组织中ATP水平降低，线粒体辅酶Ⅰ的还原形-NADH含量升高以及NAD+/NADH显著降低。上述结果表明，氧化应激一方面影响饲料育家蚕脂肪体细胞DNA分子稳定性，另一方面影响组织内线粒体功能致使能量合成水平降低。最后，参考课题组已有的桑叶育家蚕和饲料育家蚕脂肪体组织代谢组数据，筛选出左旋肉碱可能为影响饲料育家蚕糖脂代谢的因素，在BmE细胞水平探究其具体功能。结果显示，外源添加左旋肉碱促进细胞内CPT-1和甘油三酯含量的增加，诱导脂质合成和分解代谢相关基因表达量的上调。
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