摘要
胃癌(GC)是恶性消化道肿瘤，仍然是世界范围内的癌症相关死亡主要原因。胃癌的发生和幽门螺旋杆菌感染，饮食，遗传，环境等多种因素相关。胃癌早期往往没有明显症状，等到患者发现大多已经是晚期，而晚期胃癌依然治疗困难，预后差,5年生存率不足50％。目前手术切除治疗辅助放疗化疗依然是胃癌治疗的主要手段。大量的研究证据表明LncRNA与癌症的发生发展相关，胃癌也不例外，LncRNA有望成为胃癌治疗的新靶标。化疗药物耐药是很多癌症治疗失败的原因，因此新的治疗胃癌药物研发对于胃癌治疗具有重大意义，中药来源的天然小分子化合物被认为具有很大潜力，新型疗法的出现有助于逐步降低胃癌死亡率。 鸦胆子，是苦木科鸦胆子属植物，自清代起入药，具有清热解毒、抗疟、止痢的功效，外用可腐蚀赘疣，具有悠久的使用历史。鸦胆子素D(BD)，一种从鸦胆子种子中提取苦木素类化合物，具有抗炎、抗疟疾和抗癌作用。针对鸦胆子素D构效关系的研究发现，其不饱和烯醇式结构是其发挥药效的关键官能团，双键被加成后丧失大部分药物活性。大量的研究结果显示，鸦胆子素D具有优越的抗肿瘤活性，在肺癌，胰腺癌，肝癌等多种癌症中均发现其对肿瘤的抑制作用。目前，鸦胆子素D对胃癌的抑瘤作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨鸦胆子素D胃癌的功能。我们的主要研究结果如下: 1.鸦胆子素D抑制胃癌细胞的增殖和迁移 我们首先测量了鸦胆子素D对于胃癌细胞系HGC-27,MKN-45和MGC-803的IC50值，以确定后续实验的加药浓度。随后我们进行了 MTT和平板克隆实验，结果显示加药处理后明显抑制胃癌细胞的生长和克隆形成能力，接着通过Western blot实验进一步验证这一结果，我们发现鸦胆子素D处理明显抑制β-catenin及其下游的C-myc和Cyclin D1的表达水平。接下来对转录组数据进行分析，发现除了增殖鸦胆子素D很可能抑制胃癌细胞迁移，我们设计了划痕和Transwell实验，实验结果证实了我们的猜想，加药处理后明显抑制胃癌细胞的划痕愈合速率和细胞穿过率，Western blot实验结果表明鸦胆子素D处理上调E-cadherin,MMP9和MMP2下调，与划痕和Transwell实验实验结果相一致，证明了鸦胆子素D抑制胃癌细胞的迁移。 2.鸦胆子素D下调LINC00969表达 接下来我们想探究鸦胆子素D抑制胃癌细胞增殖和迁移的机制，通过转录组数据筛选出12个加药处理后明显下调的LncRNA,进一步通过荧光定量PCR实验检测，最终我们选取LINC00969为研究目标。Kaplan-Meier数据库分析发现LINC00969高表达与胃癌患者不良预后相关，表达谱也显示出LINC00969在各种胃癌细胞系中表达水平较高，在人胃上皮细胞GES-1中的表达水平较低，提示LINC00969可能在胃癌中起到了促癌作用，接下来我们构建了 LINC00969过表达载体，并通过慢病毒法构建了稳转细胞系，荧光定量PCR的结果证实我们构建的细胞系确实是过表达成功可用于后续的实验。通过MTT,EdU，平板克隆，划痕和Transwell实验发现，过表达LINC00969可适当恢复鸦胆子素D处理对胃癌细胞的增殖迁移抑制，Western blot也显示出相同的实验结果，过表达LINC00969后β-catenin、C-myc、Cyclin D1的表达水平上调，而过表达LINC00969细胞中进行加药处理可一定程度上恢复鸦胆子素D处理对β-catenin、C-myc、Cyclin D1的表达水平的下调。过表达LINC00969后E-cadherin下调，MMP9和MMP2上调，过表达LINC00969细胞中进行加药处理可一定程度上恢复鸦胆子素D处理后E-cadherin上调，MMP9和MMP2下调现象。以上实验结果得知鸦胆子素D通过下调LINC00969来抑制胃癌细胞增殖和迁移。 3.鸦胆子素D通过LINC00969/miR-488-5p/DIXDC1轴抑制胃癌细胞增殖和迁移 基于以上实验结果，LINC00969是鸦胆子素D抑制胃癌细胞增殖和迁移所必须的，接下来我们想进一步探究LINC00969发挥其生物学功能的机制，我们通过数据库预测了可能与LINC00969相互作用的miRNA,通过双荧光素酶实验验证了LINC00969与miR-488-5p之间存在结合，荧光定量PCR实验进一步验证了两者之间的相互作用。通过表达谱发现miR-488-5p在各种胃癌细胞系中表达较低，在人胃上皮细胞GES-1中表达较高，且鸦胆子素D处理上调miR-488-5p表达，我们推测miR-488-5p可能在胃癌中发挥肿瘤抑制因子作用，我们对miR-488-5p靶向基因进行预测，并通过Western blot实验验证了 miR-488-5p靶向抑制DIXDC1表达。过表达LINC00969上调DIXDC1表达，过表达LINC00969后加入miR-488-5p模拟物能部分恢复LINC00969对DIXDC1的上调。鸦胆子素D处理下调DIXDC1表达，与转录组数据显示的一致。因此，鸦胆子素D通过LINC00969/miR-488-5p/DIXDC1轴抑制胃癌细胞增殖和迁移。 4.鸦胆子素D在体内通过LINC00969抑制胃癌细胞成瘤能力 上述实验均在体外进行，接下来我们准备验证小鼠体内实验结果是否与体外结果相一致。我们进行了小鼠皮下成瘤实验，分为四组，一组为DMSO对照组，一组为鸦胆子素D治疗组，一组为LINC00969过表达组，一组为LINC00969过表达加鸦胆子素D治疗组。待肿瘤细胞注射约一周后，相应组进行鸦胆子素D治疗，并记录小鼠体重和肿瘤大小，21天后收取肿瘤，结果发现，鸦胆子素D治疗组的小鼠肿瘤体积与对照组相比更小，而LINC00969 过表达组小鼠肿瘤体积较大，说明鸦胆子素D在体内抑制胃癌细胞成瘤能力，LINC00969在体内促进胃癌细胞成瘤。LINC00969过表达后进行鸦胆子素D治疗可适当恢复鸦胆子素D对胃癌细胞成瘤能力的抑制，与体外实验结果相符合。我们初步检测鸦胆子素D的毒副作用，鸦胆子素D治疗后小鼠体重和生物学行为没有明显变化，取心肝脾肺肾进行H&E染色，并未发现有明显病理学变化，说明在2毫克每千克浓度治疗条件下，鸦胆子素D并未表现出严重的毒副作用。 综上所述，鸦胆子素D通过下调LINC00969/miR-488-5p/DIXDC 1轴抑制胃癌细胞的增殖和迁移，提示鸦胆子素D是一种很有前景的胃癌治疗药物。
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