家蚕起源于中国的野桑蚕，在经过了 5000多年的人工驯化和改良后，家蚕的蚕茧产量和质量等经济性状得到了显著提高，但长期的室内饲养也导致了家蚕适应外界环境变化的能力下降。且家蚕属于变温动物，对温度变化极为敏感，高温会影响家蚕的免疫力、蚕丝质量、生殖能力，甚至危及生命;而低温会使家蚕生长缓慢，发育不齐，最终给蚕桑产业带来严重的损失。 家蚕的代谢包括碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。代谢对家蚕的生长、发育、生殖、抗逆和免疫等方面都有着重要的影响。合理的控制代谢过程，有助于获得更加高产、高质量的家蚕。作为昆虫血淋巴中普遍存在的主要糖类，海藻糖这种代谢产物不仅能够作为储能物质为昆虫提供能量，还可以在其受到如热、冷、氧化、缺氧或干燥等不利环境条件的影响时起保护作用。海藻糖还被发现可以通过调控其下游的分子靶标，激活细胞抗氧化过程，同时上调抗氧化相关基因的表达，从而提高细胞在不利条件下的存活率。海藻糖-6-磷酸合酶TPS(Trehalose-6-Phosphate Synthase)是昆虫和其他无脊椎动物合成海藻糖的关键酶。研究表明，TPS基因表达的变化与许多生物对冷热胁迫的耐受力相关，例如酵母、水稻、山松甲虫等。 已有研究发现在家蚕受到45℃的热胁迫时，血淋巴中海藻糖的含量明显增加。而当蓖麻蚕的滞育蛹暴露于2℃的低温时，其脂肪体糖原转化为血淋巴海藻糖。但海藻糖在家蚕应对冷热温度胁迫中的具体作用还有待进一步研究，海藻糖合酶基因BmTPS的鉴定和功能研究还尚未见报道。因此，深入探究海藻糖和TPS在家蚕适应温度胁迫中的功能，不仅可以帮助我们更深入地了解家蚕对温度的适应机制，还可以为家蚕育种提供理论基础和实践指导。在本研究中，我们首先对家蚕BmTPS基因进行了生物学信息及基因表达特征分析，然后检测了温度胁迫在家蚕胚胎细胞系(BmE)及家蚕个体中对BmTPS基因表达及海藻糖合成的影响，并在细胞以及个体水平上增量表达来探索BmTPS在家蚕受到冷热温度胁迫时的生物学功能。主要研究结果如下: 1.BmTPS基因的基本信息分析 我们利用检索比对的方式，在家蚕全基因数据库(SilkDB)以及NCBI中鉴定到了家蚕的海藻糖-6-磷酸合酶基因，并将其命名为BmTPS。对BmTPS染色体位置、基因组序列和蛋白质序列进行分析，发现其位于12号染色体上，由13个外显子组成，CDS序列长度为2490bp,编码829个氨基酸，其蛋白大小约为93.6 kDa,等电点为6.83。保守结构域分析表明，BmTPS的结构与果蝇等昆虫相似，均由海藻糖-6-磷酸合酶（TPS）和海藻糖-6-磷酸酯酶（TPP）这两个保守结构域组成。TPS的系统进化分析显示，家蚕TPS与赤拟谷盗聚为一支，而与冈比亚按蚊的亲缘关系较远。 通过实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）对家蚕5龄3天幼虫的BmTPS组织表达谱分析，结果显示，BmTPS在家蚕幼虫的各个组织中均有表达，在脂肪体中表达量最高，在精卵巢、表皮等组织中也有一定量的表达。海藻糖合成的主要场所位于脂肪体，BmTPS在家蚕脂肪体中的时期表达谱分析结果显示，BmTPS在脂肪体各个时期中持续表达，在幼虫期表达量较低，眠期表达量增加，在蛹期时的表达量也明显增多。 2.BmTPS在细胞和个体水平均能响应温度胁迫 对家蚕胚胎细胞BmE及家蚕个体进行17℃的低温胁迫、37℃的高温胁迫，在胁迫3h，6h,9h后检测BmTPS、海藻糖转运体BmTret1的转录水平变化。结果显示，被温度胁迫的细胞和家蚕脂肪体中BmTPS和BmTret1的转录水平显著升高。同时，经测定发现，无论细胞水平还是个体水平，TPS酶活在温度胁迫下也明显升高，从而使BmE细胞内海藻糖的含量增多。以上实验结果表明，在细胞和个体水平，温度胁迫均会促进海藻糖的合成和转运，暗示BmTPS可能参与家蚕对温度胁迫的抵抗过程。 3.BmTPS参与家蚕细胞及个体对低温胁迫的抵抗 为了探究海藻糖在家蚕细胞低温胁迫中的作用，我们向BmE细胞中添加外源海藻糖并检测其在低温下的细胞活力变化。首先通过细胞毒性检测，确定了在0-20 μM浓度范围内添加海藻糖对BmE细胞无毒性影响，最终选取5μM浓度的海藻糖处理BmE细胞，并进行低温胁迫。结果显示，与正常培养基培养的对照组相比，添加海藻糖的BmE细胞活力提高了 21％。随后，通过转染过表达载体在BmE细胞中过表达BmTPS,发现过表达BmTPS的细胞在低温胁迫下的细胞活力升高了约8％。这些结果表明，海藻糖的添加和BmTPS的过表达均能够在一定程度上保护BmE细胞在低温胁迫下的细胞活力。 利用piggyBac转基因系统获得全身性过表达BmTPS的转基因家蚕，命名为BmTPS-OE,qRT-PCR结果显示在转基因家蚕的多个组织中BmTPS的表达量均高于对照。BmTPS-OE生长发育及经济性状调查结果表明，其生长周期、表型、经济性状均与对照家蚕无明显差异，但其五龄幼虫的体重存在明显降低。对BmTPS-OE家蚕进行低温胁迫处理后发现，BmTPS-OE幼虫在低温处理后的体重显著高于对照。该结果表明，BmTPS在个体水平的过表达能够促进低温下家蚕的生长，从而抵抗低温胁迫的影响。 已有研究表明海藻糖能够通过影响生物体内抗氧化酶相关基因的表达，从而使生物对环境压力的耐受力增加。对BmTPS过表达的BmE细胞和转基因家蚕进行相关基因的qRT-PCR检测，结果显示，无论在细胞水平还是个体水平，BmTPS的过表达都能够提高抗氧化酶BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmGST、BmGpx,等基因的表达水平，说明BmTPS可能通过调控抗氧化酶相关基因的表达，提高家蚕细胞和个体对温度胁迫的耐受性。 4.BmTPS在家蚕细胞及个体受高温胁迫时的作用 使用5μM海藻糖处理BmE细胞后对其进行高温胁迫，与对照相比，添加海藻糖的细胞在高温处理后的细胞活力增加约28％,存活率提高了 14％左右。而BmTPS过表达细胞的细胞活力及存活率分别比对照增加12％和10％。表明添加海藻糖与BmTPS的增量表达均可增强家蚕细胞对高温的适应性。为了进一步研究BmTPS基因在蚕个体中的功能，我们对BmTPS-OE蚕进行高温胁迫处理，结果显示，在高温下，与对照D9L相比，BmTPS-OE雄性幼虫体重明显增加，存活率提高20％左右，而雌性幼虫的存活率比对照降低10％左右。同时，我们发现对照D9L雌性蚕在高温下的存活率明显高于雄性，但是，BmTPS-OE雌雄家蚕却没有显著性差异。个体水平的结果表明，在相同条件下，不同性别家蚕对高温的耐受性存在差异，TPS过表达可增强雄性家蚕高温耐受能力，但是雌性家蚕耐受高温的能力会受到影响。 综上所述，本研究鉴定和克隆了家蚕的海藻糖-6-磷酸合酶TPS基因，并对其基本生物学信息及时空表达特征进行了分析。发现BmTPS基因参与了家蚕对温度胁迫的相应，细胞水平添加海藻糖或过表达BmTPS能够提高细胞对温度胁迫的耐受，个体水平过表达BmTPS除了会影响雌性家蚕在高温下的存活率外，整体上提高了家蚕对温度的耐受性。本研究探索了海藻糖及其合酶基因BmTPS在家蚕抵御温度胁迫中的作用，提高了家蚕对温度胁迫的抵抗力，可能有助于将家蚕养殖的范围扩大到平均温度不理想的地理区域和季节，同时为其他具有经济价值的昆虫的分子育种提供策略。
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