摘要
免疫系统是机体衰老最早的系统之一。免疫力属于中医的“正气”范畴。中医理论认为“正气存内，邪不可干”，正气由肾中之精所化生，肾精充则正气足，肾精亏则正气衰。课题组前期研究发现，阴阳双补，补肾益精的经典方右归饮对肾精亏虚所致生殖功能低下、骨质疏松、贫血、学习记忆障碍，以及免疫功能低下等疾病具有显著改善作用，且其作用机制与促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）具有密切关系。但EPO与免疫功能的关系需要进一步验证，其作用靶点、生物学信号通路等机制有待进一步阐明。因此本课题拟利用全身性条件性EPO基因敲除小鼠和自然衰老肾精亏虚模型小鼠探究EPO与免疫功能的相关性及其关联机制，并探究右归饮是否通过EPO改善自然衰老肾精亏虚小鼠的免疫衰老。本文的研究获得了国家自然科学基金面上项目（No.81473549）的资助。 目的： 1.进一步验证EPO与免疫功能的相关性，并探究其关联的机制。 2.观察右归饮对自然衰老肾精亏虚小鼠免疫衰老的改善作用。 3.探究右归饮改善肾精亏虚免疫衰老的作用机制与EPO及其信号通路的相关性。 方法： 1.全身性EPO基因敲除小鼠试验方法:(1)模型构建:将被Loxp序列锚定的“EPOflox/flox小鼠”和基因敲除工具鼠“Rosa26-CreERT2小鼠”交配，获得EPOflox/flox-CreERT2待敲除小鼠，12周龄时腹腔注射25mg·kg-1他莫昔芬执行EPO基因敲除，每天一次连续5天。（2）模型成功标准:以琼脂糖凝胶电泳进行脾脏DNA鉴定，结果显示成功执行了EPO基因敲除;并且与EPOf/f小鼠相比，被执行小鼠血清和脾脏EPO显著降低。 2.自然衰老小鼠试验方法:（1）模型构建:C57/BL6J小鼠雌雄各半正常饲养至16月龄。（2）衰老模型成功标准:与2月龄小鼠相比，自然衰老小鼠弓背蜷缩、体毛稀疏易脱落，自主活动次数、转棒时间、血清SOD和GSH-Px显著降低，ROS、MDA含量显著升高。（3）肾精亏虚模型成功标准:与2月龄小鼠相比，下丘脑-垂体-肾上腺轴:血清CORT、CRH显著升高，ACTH显著降低;下丘脑-垂体-甲状腺轴:T3、T4显著降低;下丘脑-垂体-性腺轴指标:T、DHT显著降低。（4）免疫衰老模型成功标准:与2月龄小鼠相比，IgG、IL-2含量显著降低，TNF-α、IL-6含量显著升高。（5）分组及给药:同时满足上述三个判断标准即为自然衰老肾精亏虚免疫衰老小鼠模型。造模成功小鼠随机分为模型组、rhEPO组、右归饮5g·kg-1组、10g·kg-1组、20 g·kg-1组，各组小鼠均衡性检验无显著性差异后给药。另设2月龄青年组小鼠，每组20只。rhEPO组小鼠腹腔注射rhEPO 5000 IU·kg-1,两天一次;右归饮各给药组灌胃相应剂量右归饮，每天一次，青年组和模型组灌胃、腹腔注射等体积生理盐水，连续4周。 3.检测观察指标及方法:(1)动物一般体征:观察小鼠外观、精神状态、体重、体温、自主活动及疲劳转棒时间。(2)脏器观察:测量肾脏、脾脏、胸腺脏器指数，观察脏器病理组织切片。(3)免疫细胞检测:全自动血液细胞分析仪检测WBC，Lymph、Gran、Mon数量;非抗原刺激法刺激法检测淋巴细胞增殖能力，LDH释放法检测NK细胞杀伤力，中性红吞噬法检测巨噬细胞吞噬能力及流式细胞分析仪检测淋巴细胞亚群比例。(4)免疫因子检测:ELISA 检测血清胸腺肽α1、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、C3、C4、IgG、IgM含量。(5)氧化应激指标检测:ELISA检测血清SOD、MDA、ROS、GSH-Px。(6)肾精亏虚指标检测:ELISA检测血清肾上腺轴指标CRH、ACTH、CORT,甲状腺轴指标T3、T4,性腺轴指标T、DHT。(7)ELISA检测血清EPO、EPOR含量。 结果： 1.全身性EPO基因敲除(EPO-KO)小鼠构建成功，且具有肾精亏虚及免疫衰老表现:(1)EPO-KO小鼠构建成功:EPOf/f小鼠扩增出1598 bp左右大分子量条带，EPO-KO小鼠扩增出200 bp左右小分子量条带;与EPOf/f相比，EPO-KO小鼠血清EPO、EPOR含量及及脾脏EPO表达显著降低(P＜0.05)。(2)EPO-KO小鼠具有衰老:与EPOf/f小鼠相比，EPO-KO 小鼠 SOD、GSH-Px 显著降低，MDA、ROS 显著升高(P＜0.05)。(3)EPO-KO小鼠具有肾精亏虚:与EPOf/f小鼠相比，EPO-KO小鼠肾脏组织形态发生明显改变，肾小球囊腔扩张，视野中出现空泡;外周血RBC、HGB、HCT显著降低;血清中CRH、ACTH、T3含量显著降低，CORT显著升高(P＜0.05)。(4)EPO-KO小鼠具有免疫衰老:与EPOf/f小鼠相比，EPO-KO小鼠脾脏淋巴小结减少，胸腺严重萎缩，免疫器官脏器指数，外周血中免疫细胞数目，血清中IL-2、IL-6、IgG含量显著降低，脾脏CD3+T细胞数量、胸腺肽α1、TNF-α含量显著升高(P＜0.05)。 2.自然衰老小鼠具有肾精亏虚及免疫衰老且EPO表达降低:(1)自然衰老模型小鼠成功:与青年组相比，自然衰老小鼠体毛粗糙稀疏，缺乏光泽，体重增长减缓;自主活动次数，疲劳转棒时间及血清SOD、GSH-PX含量均显著减少，血清MDA、ROS显著升高(P＜0.05)。(2)自然衰老模型小鼠具有肾精亏虚:与青年组相比，自然衰老小鼠肾脏肾小管管腔扩张，肾小球囊腔明显扩张，外周血RBC、HGB、HCT显著降低，肾上腺轴:血清CORT、CRH显著升高，ACTH显著降低;甲状腺轴:T3、T4显著降低;性腺轴指标:T、DHT显著降低(P＜0.05)。(3)自然衰老模型小鼠具有免疫衰老:脾脏淋巴小结及淋巴细胞数量减少，胸腺严重萎缩，胸腺指数降低。与青年组相比，自然衰老小鼠外周血WBC、Lymph数目、CD3+T细胞数量及T、B淋巴细胞增殖能力，腹腔巨噬细胞的吞噬能力显著降低，CD8+T细胞比例，CD4+/CD8+显著升高(P＜0.05)。与青年组相比，自然衰老小鼠血清中IL-2、IL-10、IgG、C3、C4含量显著降低，胸腺肽α1、IL-6、IFN-γ、TNF-α显著升高(P＜0.05)。(4)自然衰老模型小鼠EPO表达降低:与青年组相比，模型组小鼠血清EPO和EPOR含量及脾脏中EPO表达显著降低(P＜0.05)。 3.补充外源性EPO对自然衰老肾精亏虚免疫衰老小鼠具有显著改善作用。(1)显著改善其衰老:与模型组相比，rhEPO组小鼠自主活动次数及血清SOD、GSH-Px均显著升高，血清MDA、ROS显著降低(P＜0.05)。(2)显著改善其免疫衰老:与模型组相比，rhEPO组小鼠免疫器官组织形态有所改善，脾脏指数显著升高，脾脏NK细胞的杀伤活性及CD3+T细胞数量均显著升高，CD8+T细胞比例，CD4+/CD8+均显著降低(P＜0.05)。与模型组比，rhEPO组小鼠血清中胸腺肽α1、TNF-α、IgM显著降低，IL-2、IL-10、IgG、C4表达显著升高(P＜0.05)。(3)显著改善其肾精亏虚:与模型组比，rhEPO组小鼠血清中 CRH、CORT 显著降低，RBC、HGB、HCT、T3、T4、ACTH 显著升高(P＜0.05)。 4.EPO与免疫衰老相关的信号通路为EPO-JAK2/STAT3-FOXO1。(1)网络预测免疫衰老的作用机制:检索得到免疫衰老潜在靶蛋白126个,PPI筛选得到包括STAT3、TNF、IL6、IL2、JAK2等20个重要靶蛋白。KEGG通路富集分析得到免疫衰老可能相关的通路，包括JAK/STAT、FOXO通路。(2)动物试验验证EPO-JAK2/STAT3-FOXO1信号通路与免疫衰老相关:与EPOf/f小鼠相比,EPO-KO小鼠脾脏中的EPO、EPOR、JAK2、STAT3、FOXO1的表达显著降低;与青年组相比，自然衰老肾精亏虚免疫衰老小鼠脾脏EPO、EPOR、JAK2、STAT3、FOXO1表达显著降低;外源性补充rhEPO显著升高自然衰老肾精亏虚免疫衰老小鼠血清EPO、EPOR含量，及脾脏EPO、EPOR、AK2、STAT3、FOXO1蛋白表达（均P＜0.05）。 结论： 1.全身性EPO基因敲除小鼠具有肾精亏虚和免疫衰老的临床表型。自然衰老肾精亏虚免疫衰老小鼠，同时伴有血清和脾脏中EPO的显著降低。补充外源性EPO对自然衰老肾精亏虚免疫衰老小鼠的宏观衰老、免疫衰老、肾精亏虚表现均具有显著改善效果。上述三方面均证明了 EPO与肾精亏虚及免疫衰老具有密切相关性。 2.网络药理学预测结果，及全身性EPO基因敲除小鼠和自然衰老肾精亏虚免疫衰老小鼠试验验证结果，均表明免疫衰老与EPO-JAK2/STAT3-FOXO1信号通路相关。 3.右归饮对自然衰老肾精亏虚免疫衰老小鼠的肾精亏虚和免疫衰老，均具有显著的改善作用。能显著增强其抗氧化应激能力，显著改善其肾脏组织病理变化，显著调节肾上腺轴激素等肾精亏虚系列指标，显著增强免疫细胞功能，显著调节免疫因子水平。 4.右归饮改善自然衰老肾精亏虚免疫衰老的作用机制，与升高血清和脾脏中的EPO,促进信号通路EPO-JAK2/STAT3-FOXO1蛋白的表达相关。
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