摘要
工业化导致全球突发性极端天气的频率上升，如何适应冬季的低温和突发性寒潮是温带和亚热带地区昆虫所面临的巨大生存挑战。昆虫耐寒力的高低是其在不良的低温环境中种群存在与发展的重要前提。丝带凤蝶Sericinus montelus具有很高的观赏价值，但正濒临灭绝。丝带凤蝶以滞育蛹越冬，其耐寒性是否与滞育相关，以及具体机制为何尚不清楚。因此，为揭示丝带凤蝶越冬蛹耐寒的生理特征及其调控机制，本研究在实验室和户外饲养了滞育和非滞育丝带凤蝶，采用过冷却点智能检测仪检测了滞育蛹和非滞育蛹的过冷却点，利用生化物质含量测试和高效液相色谱法对滞育蛹和非滞育蛹的含水量、能量物质、小分子抗冻保护剂、耐寒相关酶活性进行比较分析，采用便携式呼吸测量系统对滞育蛹和非滞育蛹的代谢率和呼吸模式进行了检测和比较。同时，对野外自然条件下不同季节蛹的上述部分指标进行了检测。最后，分析了快速冷驯化对耐寒能力和耐寒性相关物质的影响，主要结果如下: 1.过冷却点 丝带凤蝶滞育蛹和非滞育蛹、夏季蛹和越冬蛹的过冷却点检测结果表明，滞育蛹的过冷却点显著低于非滞育蛹，越冬蛹的过冷却点显著低于夏季蛹，滞育蛹和越冬蛹的过冷却点最低分别为-26和-24℃,远低于湖南冬季最低温度。滞育蛹经-24℃冷暴露2h后，存活羽化率为20％,过冷却点与较低致死温度之间高度相关，因此降低过冷却点是丝带凤蝶滞育越冬蛹的主要耐寒策略之一，推测丝带凤蝶属于避免结冰型昆虫。 2.含水量 各蛹龄的非滞育蛹自由水和结合水含量均无显著差异。随蛹龄增加，滞育蛹自由水含量逐渐下降，结合水含量逐渐增加。除1日龄外，其他蛹龄滞育蛹的自由含水量均显著低于非滞育蛹，结合水含量均显著高于非滞育蛹。在化蛹后第1、4、8d,滞育蛹与非滞育蛹之间总含水量无显著性差异。滞育蛹的12h脱水速率均显著低于非滞育蛹，滞育蛹12 h脱水速率随着蛹龄增加而显著下降。表明丝带凤蝶滞育蛹可能通过降低游离水含量来提高其耐寒性。 3.能量物质 滞育蛹和非滞育蛹的蛋白质、脂肪、总糖和糖原的含量，以及越冬蛹的蛋白含量检测结果表明，滞育蛹和非滞育蛹化蛹后蛋白质含量均下降，滞育蛹与非滞育蛹之间蛋白质含量无显著差异。越冬蛹蛋白含量无显著变化。非滞育蛹的总糖、脂质和糖原含量在成虫羽化前迅速下降。滞育蛹在化蛹后总糖含量逐渐上升，蛹糖原和脂质含量的变化与总糖含量的变化相反。滞育蛹在滞育维持期(化蛹8d后)的脂质、糖原和总糖含量均显著高于非滞育蛹。丝带凤蝶滞育蛹在滞育前期耗尽糖原储备，糖原可能转化为单糖或糖醇，在滞育30 d后转而利用脂质。说明滞育蛹具有以脂质、糖原和糖的形式储存能量的能力，并能在滞育期间的代谢抑制期利用这些能量。 4.小分子抗冻保护剂 采用高效液相色谱技术检测了丝带凤蝶滞育蛹和非滞育蛹、夏季蛹和冬季蛹的小分子抗冻保护剂含量，选择8种在昆虫中常见的冷冻保护剂标准品，虫体中海藻糖、葡萄糖和山梨醇的含量达定量限。结果表明滞育蛹和越冬蛹中的葡萄糖和山梨醇含量未发生耐寒相关的显著性变化。滞育蛹海藻糖含量从化蛹开始时的7 μg/mg显著增加到化蛹后第30 d的16μg/mg。户外蛹海藻糖浓度从夏季9 μg/mg,到11月上升至12 μg/mg并在冬季维持较高水平，次年3月则显著降低至4 μg/mg。且户外蛹海藻糖和过冷却点呈现相反的变化趋势。因此推断海藻糖是丝带凤蝶蛹的冷冻保护剂。 5.耐寒性相关酶活性 测试比较了丝带凤蝶滞育蛹和非滞育蛹及户外越冬蛹的过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)4种酶活性。结果表明SOD活性和POD活性未发生耐寒相关的显著性变化。1日龄非滞育蛹CAT活性显著高于滞育蛹，滞育蛹ADH活性化蛹后4 d开始增加，在30 d内都稳定在较高水平。越冬蛹CAT活性在越冬后显著下降，ADH活性越冬期显著上升，3月显著下降。说明CAT和ADH两种酶或许与丝带凤蝶滞育越冬蛹的耐寒性提升有关。 6.呼吸模式和代谢率 通过检测对比丝带凤蝶滞育蛹和非滞育蛹、夏季蛹和越冬蛹的呼吸代谢和呼吸模式，结果表明丝带凤蝶蛹期呼吸模式存在变异性，至少存在连续气体交换和不连续气体交换两种呼吸模式。所有的滞育蛹、冬季蛹、和低温(15℃)状态下的非滞育蛹均呈不连续气体交换呼吸模式，同时伴随着低代谢率，而大部分非滞育蛹、所有的夏季蛹均呈连续气体交换呼吸模式。不连续气体交换全周期、暴发期和暴发间期时长均随着蛹龄的增加和温度的降低而延长。 7.冷驯化对耐寒能力和小分子抗冻物质的影响 通过对丝带凤蝶非滞育蛹进行4℃,滞育蛹进行0℃和4℃冷驯化2、4和8h处理，结果表明0℃驯化2 h可显著提高滞育蛹的羽化率。滞育8日蛹经0℃驯化2h、8h、24h、8d和22d后，蛹体内的小分子抗冻物质含量与对照组无显著差异，结果表明合适条件的快速冷驯化反应能提升丝带凤蝶滞育蛹的耐寒能力，这种变化与小分子抗冻物质无关。 本研究表明丝带凤蝶Sericinus montelus为避免结冰型昆虫，其耐寒性与蛹滞育密切相关，其主要耐寒策略为降低过冷却点，降低呼吸代谢，呈不连续气体交换呼吸模式，减少自由水含量，积累结合水-能源-海藻糖作为抗冻物质系统，利用CAT和ADH酶的代谢调节作用增强耐寒性，在气温骤变时可能启动快速冷驯化反应耐寒。 本研究的创新点主要体现在:证实了丝带凤蝶属于避免结冰型昆虫，明确丝带凤蝶蛹的耐寒性与滞育密切相关。发现了丝带凤蝶蛹的呼吸模式存在变异性。发现快速冷驯化可显著提高丝带凤蝶滞育蛹的耐寒能力。
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