摘要
家蚕是重要的经济昆虫，丝腺是其唯一的泌丝器官，可以分泌和存储丝蛋白。根据形态和功能不同，丝腺被划分为前部丝腺(Anterior silk gland，ASG)、中部丝腺(Middle silk gland,MSG)和后部丝腺(Posterior silk gland,PSG)三个区域。ASG没有泌丝功能，是丝蛋白的运输通道;MSG是家蚕丝腺中最膨大及最显著的区段，既可以分泌丝胶蛋白，也可以暂时储存丝蛋白;PSG则是家蚕丝腺中最长且弯曲最复杂的部分，其主要的作用是合成丝素蛋白。相关研究表明，丝腺的生长发育以及丝蛋白的合成受到保幼激素(Juvenile hormone,JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的协同调控，并且这种调控作用与激素的浓度关系紧密。JH的滴度由其合成和代谢途径共同调控，保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)和保幼激素环氧水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)在JH的降解中发挥重要作用。本课题组前期通过转录组学分析发现，家蚕丝腺特异表达的jhe和jheh在家蚕的MSG高量表达，推测其可能参与丝蛋白的合成。为了研究丝腺jhe和jheh的表达模式以及发挥的功能，本研究从mRNA和蛋白质两个水平进行时空表达谱分析，并且利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)以及液相色谱串联质谱(Liquid chromatograph mass spectrometer/mass spectrometer,LC-MS/MS)等技术对其功能进行探讨。主要研究结果如下: 1.家蚕丝腺JHE和JHEH的表达与定位 首先，本研究利用生物信息学方法对Bmjhe和Bmjheh进行了分析，发现二者都存在一个保守的Ab水解酶(Abhydrolase)功能结构域。其次，为了确认Bmjhe和Bmjheh在丝腺组织的表达模式，本研究利用RT-PCR、RT-qPCR、Western blot技术对Bmjhe和Bmjheh的各组织表达谱和时空表达谱进行分析，结果表明Bmjhe和Bmjheh在家蚕丝腺高量表达;并且在MSG前部(A-MSG)表达量最高，在丝腺其它分区的表达量较低;除此之外，Bmjhe和Bmjheh在眠期和5龄末期基本不表达。利用RT-qPCR和Western blot技术对这一结果进行验证，获得类似结果。本研究还利用Bmjhe和Bmjheh抗体进行免疫荧光实验，在5龄3天家蚕丝腺中进行Bmjhe和Bmjheh的表达定位，分析发现Bmjhe和Bmjheh蛋白主要在A-MSG的细胞层中有强烈的荧光信号，同时，在A-MSG和ASG的腺腔中也检测到明显的荧光信号，表明Bmjhe和Bmjheh会分泌到丝腺腺腔中。根据上述结果，推测Bmjhe和Bmjheh可能与丝蛋白的合成相关。 2.家蚕丝腺JHE和JHEH对家蚕丝蛋白合成的影响 为了探究Bmjhe和Bmjheh在家蚕丝蛋白合成中的作用，我们利用RNAi技术对家蚕幼虫分别进行Bmjhe dsRNA和Bmjheh dsRNA连续注射，并以EGFP dsRNA为对照。检测发现实验组Bmjhe和Bmjheh基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量相比于对照组都显著下调，说明目的基因RNAi成功。此外，对5龄3天的家蚕幼虫体重进行调查，结果显示RNAi后的家蚕幼虫体重显著增加。解剖后对丝腺进行观察，发现丝腺不仅整体变大而且重量变重。继而对MSG主要丝胶蛋白基因的表达量进行定量分析，结果显示，Sericin 1(Ser1)和Sericin 2(Ser2)在MSG的表达下调，Sericin 3(Ser3)的表达上调。以上结果显示，RNAiBmjhe和Bmjheh基因后，家蚕丝腺发育异常，MSG中的丝胶蛋白基因表达混乱。除此之外，我们还检测了保幼激素通路上的关键基因，发现JH早期应答因子Krüppel homolog 1(Kr-h1)和JH受体Methoprene-tolerant-1(Met1）的表达量显著上调。因此，推测Bmjhe和Bmjheh可能参与了丝腺体内的JH的分解。 3.家蚕丝腺JHE和JHEH与激素的关系 为了深入探究Bmjhe和Bmjheh基因对激素的响应模式，我们采用体表涂抹保幼激素类似物(Juvenile hormone analogue,JHA)和体内注射20E的方式处理家蚕幼虫。实验结果显示，JHA诱导Bmjhe和Bmjheh基因的表达，20E抑制二者的表达。同时，为了进一步验证Bmjhe和Bmjheh蛋白是否具有代谢JH的能力，本研究通过原核表达系统分别表达Bmjhe和Bmjheh重组蛋白，然后采用表达在上清的Bmjhe重组蛋白与JHA进行体外孵育，通过高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)对反应产物进行鉴定。结果显示Bmjhe重组蛋白的酶活性微弱。此外，我们通过LC-MS/MS检测丝腺中JH浓度，结果表明，MSG中三种JH的含量呈现从4眠到5龄第一天先下降，之后在家蚕5龄期逐渐上升的趋势，并在第7天达到最高值，其中JH Ⅱ的含量高于JH Ⅰ和JH Ⅲ,JH Ⅰ为0.252 ng/mg,JH Ⅱ为0.357 ng/mg,JH Ⅲ为0.228 ng/mg。在家蚕幼虫5龄期间，丝腺中JH的浓度呈增长趋势，与Bmjhe和Bmjheh在家蚕丝腺5龄期的蛋白表达模式相反，表明Bmjhe和Bmjheh可能参与JH的降解过程。 综上所述，本研究首先确认了 Bmjhe和Bmjheh在幼虫期的A-MSG高量表达，且能够分泌到丝腺腺腔中。在丝腺中的功能研究表明，Bmjhe和Bmjheh能够影响JH通路关键基因的表达。随后，本研究证实了 Bmjhe和Bmjheh具备响应JH和20E的作用，而原核表达的Bmjhe蛋白酶活性微弱。最终，本研究发现在5龄期间的家蚕幼虫丝腺中JH的浓度变化趋势与Bmjhe和Bmjheh蛋白的表达模式相反。上述结果表明，Bmjhe和Bmjheh参与JH的调控过程，本研究对理解丝腺内激素调控机制有一定的指导和借鉴意义。
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