摘要
背景：气管软化(tracheomalacia，TM)是多种原因导致的气管管腔顺应性增加从而导致管腔塌陷的疾病，发病率达1/2100。重度的软化常发生紫绀、气道阻塞、呼吸急促、甚至呼吸和心跳骤停，死亡率可高达80％，是亟需解决的全球性的医学难题。气管外支架的置入是治疗重度TM的重要方法，目前3D打印技术个性化气管外支架的研究广泛开展，但现有的支架存在限制气管生长发育、匹配性欠佳、延展性差、易于移位、相容性较差的问题。因此本研究的主要目的是通过3D打印技术开发基于胶原蛋白(Collagen，Col)改性和生长因子负载的聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)的气管外支架，初步评价这种新型支架的理化性质及生物相容性，建立气管软化的小型猪动物模型，为气管软化疾病的基础研究及诊疗提供可操作的大型动物模型，并且初步评估这种3D打印的气管外支架在危及生命的气管软化的小型猪动物模型中的疗效。 方法：1.3D打印气管外支架的制备与表征:通过选择性激光烧结(Selective Laser Sintering,SLS)3D打印技术打印气管外支架，选择提拉成膜法对支架进行胶原蛋白改性，并加用骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein-2,BMP-2)进行负载，制备基于胶原改性和生长因子负载的3D打印PCL/Col/BMP气管外支架，表征支架微观结构、特征吸收峰及疏水性质。2.3D打印气管外支架的体外生物学性能的研究:提取PCL/Col/BMP气管外支架的浸提液，CCK-8比色法测试支架的细胞毒性;材料浸提液与稀释的抗凝兔血混合观察红细胞溶解情况，并通过测量上清液在545nm处的吸光度，计算溶血率。3.3D打印气管外支架的体内生物学性能的研究:通过材料浸提液腹腔注射昆明小鼠体内评估支架的全身毒性;将支架材料及对照组材料植入SPF级SD大鼠的两侧臀大肌肌肉间隙，于植入后1、4、12周HE染色后观察炎性细胞和纤维包裹情况。4.气管软化动物建模及支架置入:通过剥离气管软骨环并保留“岛状”气管软骨的方式构建小型猪气管软化的实验动物模型，术中使用电子气管镜及颈部CT判断猪气管塌陷情况并计算气管狭窄率，记录建模后小型猪的存活时间;建模成功后的实验组小型猪置入气管外支架，术后一周使用Westley scale scores量表每日评估小型猪临床症状并记录存活时间。 结果：1.本研究根据文献报道PCL气管外支架结构，设计并优化为开口90°的大C型气管外支架模型，并进行胶原蛋白改性和BMP负载，扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)结果观察到表面覆盖完整的胶原蛋白膜;傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy,FTIR)分析经胶原蛋白改性和BMP负载后，特征峰强度发生变化，两种蛋白均有修饰作用;接触角(Contact Angle,CA)测量提示经过胶原的表面改性和生长因子负载的支架水接触角显著降低，支架的亲水性显著提高(P＜0.05)。2.细胞相容性实验结果表明支架浸提液细胞毒性0～1级，细胞增殖率(Relative Growth Rate,RGR)介于89.54％～109.63％，符合医用材料毒性安全的要求。支架浸提液的溶血率为2.02％,符合体内植入的标准。3.体内全身毒性实验显示实验组和对照组小鼠饮食、活动均无异常，体重增长情况差异无统计学意义(P＞0.05);PCL/Col/BMP支架植入大鼠肌间隙1周后出现急性炎症反应，4周后炎性反应减轻，植入物周围组织有包膜形成，12周后支架周围形成致密的纤维结缔组织包膜，肌肉和结缔组织中的细胞群达到稳定状态。4.完成气管软化建模，电子气管镜显示建模后呼吸双相气管明显软化;颈部CT结果显示建模后气管明显塌陷，两只小型猪的气管狭窄率分别为81.36％和86.57％，Cotton''s狭窄分度为Ⅲ度;未置入气管外支架的小型猪于术后2h25min死亡;置入气管外支架的小型猪每日Westley量表评分，术后评分由3分上升至10分，术后1周稳定在2分，截至目前置入支架的小型猪仍存活。 结论：本研究完成了基于胶原蛋白改性和生长因子负载的PCL3D打印气管外支架的制备，通过表征分析表明其具有良好的理化性质。体外实验初步证明其具有良好的细胞相容性，符合医用材料安全性标准。体内全身毒性试验表明支架浸提液没有全身毒性，材料植入肌肉后对组织刺激小，具有优异的生物相容性。通过剥离气管软骨并保留“岛状”软骨的方式成功建立了气管软化的小型猪动物模型，气管外支架的置入可改善气管软化小型猪的临床症状，提高了小型猪的存活时间。
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