摘要
马铃薯(Solanum tuberosum L.)为茄科双子叶植物，是我国继水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。马铃薯营养丰富，亦粮亦蔬，适应性强，产量高。马铃薯产业也是少、边、山地区脱贫致富的优势产业，在保障我国粮食安全、促进农业农民增效增收方面发挥关键作用。 马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是马铃薯的重要病害之一，严重影响其生长发育，造成大幅减产和品质下降。据报道，PSTVd强株系引起的减产高达60％,而弱株系减产约20％～35％，造成严重的经济损失。由于PSTVd无法通过茎尖脱毒和组织培养汰除以及缺乏抗病品种，目前无法有效防治PSTVd病害的发生。当前基因编辑技术高速发展，广泛应用于基因编辑、诊断和表达调控等方面。植物基因编辑技术的开发大幅缩短了育种年限,加速了育种进程，目前利用基因编辑技术已创制多种农作物的抗病毒种质资源。但该技术在马铃薯中应用较少，因此，本研究拟通过基因编辑技术，创制抗PSTVd的马铃薯种质资源。 本研究采用两种不同的基因编辑策略创制抗PSTVd马铃薯种质资源:1)利用CRISPR-Cas9系统敲除马铃薯内源基因Virp1,该蛋白与PSTVd互作，促进其增殖，是PSTVd在寄主细胞内增殖不可或缺的关键因子;2)利用CRISPR-Cas13d系统编辑PSTVd的基因组RNA,破坏其基因组，抑制增殖。对于Cas9系统，本研究将sgRNA位点设计在Virp1的5''端;对于Cas13d系统，本研究在PSTVd不同功能域分别设计4个不同靶点，且分别通过单一和多crRNA靶向PSTVd的基因组RNA。由于尚不清楚PSTVd的敏感材料，因此本研究先对课题组不同马铃薯品种进行筛选，获得PSTVd的敏感材料，然后通过农杆菌介导的遗传转化、筛选、验证创制抗PSTVd马铃薯种质材料，主要研究结果如下: 1.PSTVd敏感品种筛选。选取克新18(K18)、希森6号、大西洋、鄂薯3号和Desiree接种PSTVd-S。侵染21d后，发现K18表现出明显的矮化、束顶病征，而其他4个马铃薯品种无明显病征。进一步提取叶片总RNA,通过qRT-PCR检测PSTVd的积累量，结果显示K18的PSTVd积累量显著高于其他4个品种，表明K18为PSTVd的敏感品种，因此本研究以K18为材料进行马铃薯抗PSTVd资源材料的创制实验。 2.CRISPR-Cas9系统的构建与遗传转化。本研究设计了靶向Virp1 5''端的靶点，构建了靶向Vrp1的CRISPR-Cas9载体，经遗传转化获得18株阳性苗，但经测序显示Virp1并未被编辑。我们推测:一方面获得的阳性苗不够，缺少编辑活性高的株系;另一方面，Cas9蛋白的编辑活性不够，因为马铃薯的生长温度是22℃，遗传转化全程处于该环境温度，而Cas9来自Streptococcus pyogenes 菌,最适温度是35-45℃,所以导致编辑效率低。 3.CRISPR-Cas13d系统的构建。本研究设计了靶向PSTVd的左末端区(the terminal left,TL)、中央保守区(the central conserved region,CCR)、可变区(the variable,V)和致病区(the pathogenicity,P)的 crRNA,分别命名为 crRNA1、crRNA2、crRNA3、crRNA4,构建了靶向 PSTVd 的 4 个 CRISPR-Cas13d 单靶点载体和1个四靶点载体。通过农杆菌介导的遗传转化、抗生素筛选、PCR鉴定，获得15株抗PSTVd阳性转基因植株:单靶点和混合靶点株系10个，四靶点株系5个。表型观察发现，除一株混合靶点株系外，其余14个株系表型无异常，表明这些株系中的T-DNA插入未显著影响其生长发育。 4.CRISPR-Cas13d基因编辑株系的PSTVd抗性评价。对单靶点和多靶点转基因株系与野生型马铃薯接种PSTVd,通过表型观察以及Northern Blotting检测，结果显示:(1)转基因株系接种类病毒前后无明显矮化的病征，并且转基因株系中PSTVd成熟体RNA积累量以及PSTVd衍生的小RNA显著少于对照组;(2)在单靶点的转基因株系中，crRNA4的靶向效果优于crRNA1;(3)在混靶点转基因株系中，靶点数量越多，PSTVd成熟体积累量以及PSTVd产生的小RNA积累量越少，但抗性不优于crRNA4的单靶点转基因株系;(4)在四靶点转基因株系中，PSTVd成熟体RNA积累量和PSTVd产生的小RNA积累量均降低了 50％以上，整体靶向效果较优。
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