摘要
甘蓝型油菜(Brassica napus)是产油效率最高的油料作物之一，是我国国产植物油的第一大油源。但是油菜的产量水平低，原因是经济系数低，而且严重植株倒伏、病虫害、旱涝胁迫、高低温胁迫以及低效的机械化收割等。通过多种手段提高油菜的产量，已成为我国油菜遗传改良的重中之重。 MYB 转录因子(V-MYB avian myeloblastosis viral oncogene homologs)在植物中家族基因数量庞大，功能繁多，几乎参与调控植株生长发育与代谢的各个方面，在植物对生物胁迫和非生物胁迫的反应中也发挥重要作用。MYB86属于R2R3型MYB转录因子，其功能在植物界目前还鲜有报道。 本课题组此前研究表明，甘蓝型油菜MYB86(BnMYB86)家族在茎、根等木质化器官中优势表达，而且快速响应核盘菌诱导，推测BnMYB86同时参与调控次生壁木质化和抗病性。因此，本研究分析了BnMYB86家族的分子特征，利用超表达转基因油菜揭示了BnMYB86调控农艺性状和维管发育-次生木质化的功能。构建了甘蓝型油菜的全长cDNA文库，通过酵母双杂交(Y2H)筛库、生信预测及功能特征提出了 MYB86的候选互作蛋白，并进行了 Y2H和双分子荧光互补(BiFC)验证，揭示了 MYB86的一批互作蛋白。此外，以拟南芥MYB86启动子为诱饵进行酵母单杂交(Y1H)筛库，结合生信预测及功能特征，提出了MYB86的候选上游转录因子，并进行了 Y1H和双荧光素酶报告实验(LUC)验证，揭示了结合MYB86启动子的多个上游转录因子。 1.BnMYB86 家族的分子特征 BnMYB86家族有6个成员，基因长度1008-1073 bp,均有2个内含子，氨基酸残基数335-357，分子量37.86-40.50 kDa,等电点7.1-7.6,磷酸化位点数在38-41之间，其中丝氨酸磷酸化占比均为最高。它们编码蛋白的二级结构主要为无规则卷曲(43.42％-47.16％)，其次是α-螺旋(38.10％-34.86％)，延伸链和β-转角均在15％以下。在线预测显示这6个蛋白均无信号肽，亚细胞定位在细胞核中。多重序列比对和系统发生分析均表明，油菜的6个MYB86基因是拟南芥MYB86的垂直同源基因，核酸和蛋白水平的一致性均很高。BnMYB86在茎中表达量最高，角果和根叶也有显著表达，推测BnMYB86家族在茎等器官中发挥调控功能。 由于BnMYB86成员较多，且启动子序列在不同数据库间差异巨大，因此选用拟南芥MYB86启动子进行分析，并且预测proAtMYB86启动子的主要元件在-3275bp以内，5''端截短实验结果显示重要激活元件位于-500bp以内和-1500至-2000bp之间，并且在-500至-1500 bp区间和-2500至-3000 bp区间存在强烈的抑制性元件。 2.超量表达BnMYB86改善了油菜农艺性状，提高了产量 本课题组前期获得了超表达BnMYB86的转基因油菜，本研究对其农艺性状的观察显示，转基因株系收获期的株高极显著地增高16.2％，主茎的直径显著增加了 15.4％;虽然单叶面积极显著减小18.1％,但总叶片数极显著增加84.7％,总叶片面积极显著增加42.1％;一次分枝数和二次分枝数显著增加了 35.1％和28.1％，分枝长度也显著增加22.6％和30.7％，一次分枝直径增加了 14.1％;二次分枝角果数增加了 137.3％,单株总角果数增加了 24.6％，角果长度增加了 13.5％，角果宽减小26.9％;千粒重平均增加了 20.8％,单株籽粒产量显著性增加了 15.8％。此外，转基因植株的根长增加了 40.8％，侧根数增加了 28.2％。 组织解剖学观察表明，转基因植株韧皮部厚度增加了 50.9％,木质部厚度增加了 54.9％,束间纤维面积增加了 105％,维管束面积增加了 185％,木纤维面积增加了 131.2％,上、中、下部茎的抗折能力平均显著提升了 22.1％。 综上所述，超表达BnMYB86促进了油菜茎秆、叶片、分枝和根系的生长发育，增强了植株的维管束发育、次生壁木质化和抗倒伏能力，改善了油菜的株型，增加了分枝数、角果数和千粒重，进而显著增加油菜的籽粒产量，具有重要的分子育种潜力。 3.成功构建甘蓝型油菜的酵母杂交全长cDNA文库 以甘蓝型油菜中双11的幼根、成熟根、下胚轴、子叶、真叶、嫩茎、中期茎、老茎、蕾、花、角果皮、幼种、嫩种、中期种、老种等15个器官组织的混合RNA为起始材料，用DSN处理、SMART法构建了甘蓝型油菜均一化的酵母杂交全长cDNA文库，文库滴度为8.00×107 cells/ml,达到标准。随机挑选24个单菌落用载体引物菌检，均为阳性，片段均在500-2000bp之间，重组率100％。 4.MYB86蛋白与12个转录因子和1个染色质修饰蛋白互作 克隆BnMYB86-1和AtMYB86的编码区，插入pGBKT7载体，转化Y2HGold，进行毒性和自激活检测，结果表明诱饵质粒对酵母无毒性，都有自激活活性。抑制背景表达的3-AT浓度以AtMYB86为诱饵时为4mM，以BnMYB86-1为诱饵时为1mM。以BnMYB86-1为诱饵进行酵母双杂交文库筛选，最终测序比对得到37个潜在候选蛋白，其中有两个转录因子。综合Y2H筛库结果、网站生信预测结果和转基因功能研究结果，共提出了 39个MYB86的候选互作蛋白，构建拟南芥和油菜基因的相应载体，通过Y2H和BiFC点对点验证，共验证出13个互作蛋白，即MYB43、MYB55、MYB69、KANT1、KNAT5、KNAT7、STM、MYC2、ABS5、bHLH94、VOZ2、MAC5B 和 BRIP1。其中，MYB43、MYB55、MYB69、BRIP1在拟南芥和油菜中与MYB86均表现出强互作，STM和MAC5B在拟南芥中与MYB86表现出强互作，ABS5、bHLH94、VOZ2和MYC2在油菜中与MYB86表现出强互作。 5.来自NAC、MYB、DOF等家族的10个转录因子可以结合AtMYB86的启动子 根据分析将proAtMYB86截断成三部分，分别构建酵母单杂交（Y1H）诱饵载体，依次命名为pAbAi-PA86-P3、pAbAi-PA86-P2、pAbAi-PA86-P1，并进行抑制背景筛选，筛选浓度分别为 200、200、150 ng·mL-1。然后分别进行了 Y1H筛库，初步得到共5个转录因子。综合Y1H筛库结果、网站生信预测结果和转基因功能研究结果，提出了 33个候选上游调控因子，并分别与三个诱饵菌株进行了Y1H和LUC点对点实验，初步得到10个与proAtMYB86结合的转录因子。它们包括调控次生细胞壁发生的一级开关VND6,同为NAC转录因子的XND1、VNI2,二级开关MYB46、MYB83,与衰老和防卫相关的WRKY53,参与调控茎尖发生的STM,同为KNOX家族的KNAT3,两个DOF转录因子 DOF1.8 和 DOF5.6。 本研究初步解析了MYB86的功能和分子育种潜力，揭示了 MYB86的一批蛋白-蛋白互作转录因子以及结合MYB86启动子的多个上游转录因子，是对植物界MYB86调控功能与机理的重要贡献。
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