摘要
研究目的： 静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)是恶性肿瘤常见的并发症，也是恶性肿瘤患者常见的死亡原因，尤其与患者早期死亡密切相关。肺癌是一种发病率及死亡率均非常高的恶性肿瘤，既往研究发现它也是VTE高发的癌症类型之一，尤其是转移性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)而随着分子靶向等新兴诊疗的实施，转移性NSCLC死亡率出现明显下降。那么在目前这种分子靶向诊疗的背景下，转移性NSCLC合并VTE患者的早期死亡风险又是怎样呢？目前尚无研究。 近年逐渐有研究发现一些肿瘤的驱动基因改变可以促进肿瘤患者VTE的发生，本课题组也率先通过前瞻性队列研究，探讨了NSCLC常见驱动基因(EGFR、KRAS)基因突变、ALK基因重排与VTE的发生的关系。进一步排除EGFR和KRAS基因突变干扰后，结果表明，ALK基因重排与VTE发生呈正相关。但其具体的调控机制目前尚无研究。进一步探讨EML4-ALK融合蛋白调控肺癌相关静脉血栓栓塞症发生的分子机制研究，对深入认识肿瘤相关VTE发生的病理生理过程乃至为其防治寻求潜在新的抗凝治疗靶点都具有非常重要的意义。 研究方法： 1、本研究第一部分为前瞻性队列研究。按照研究对象的纳入及排除标准纳入北京朝阳医院2014年1月至2019年12月期间病理新诊断为非小细胞肺癌患者706例。记录入组患者的性别、年龄、吸烟史、体能状态评分和体重指数等个人资料，及病理类型、驱动基因检测结果、颅内转移情况、治疗方案等，并随访观察患者6个月内VTE事件发生及生存情况。资料总结，基于Fine-Gray竞争风险模型及Cox回归模型分别分析真实世界中晚期非小细胞肺癌患者VTE发生的独立危险因素及早期死亡的独立危险因素。 2、本研究第二部分利用表达EML4-ALK融合蛋白的人源肺癌细胞株，构建EML4-ALK融合蛋白靶向抑制细胞模型，进行二代mRNA测序，探究了EML4-ALK融合蛋白靶向抑制前后凝血相关差异基因，并在细胞系及组织中进行了验证，随后构建了人源肺癌细胞系的小鼠皮下移植模型及下腔静脉结扎模型，检测小鼠循环血中肿瘤源性差异凝血因子表达水平及探究小鼠下腔静脉血栓形成情况。最后探讨了ALK基因重排阳性肺腺癌细胞中EML4-ALK融合蛋白调控凝血因子表达的可能调控通路，并进一步予通路抑制剂处理细胞进行验证，以阐明EML4-ALK融合蛋白调控TF的可能分子机制。 研究结果： 1、共有706例新诊断的转移性NSCLC患者入组。在入组后6个月的随访期间，有12.2％(86/706)的患者发生了VTE事件。对VTE事件发生的多因素分析发现，年龄大于等于70岁(vs＜70:部分分布风险比[sub-distribution hazard radio,SHR],1.678;95％置信区间(confidence interval,CI),1.073-2.600;P=0.022),ECOG-PS(Eastern Cooperative Oncology Group performance status)≥2分(vs0/1:SHR,1.946;95％CI,1.277-2.970;P=0.002)，及合并ALK基因重排(vs ALK基因野生型:SHR,2.377;95％CI,1.186-4.760;P=0.015)与VTE的发生显著相关。同时6个月随访期内有116名患者(16.4％)死亡，Cox多因素回归分析显示合并VTE事件(vs无VTE:矫正后的HR:1.863;95％CI:1.178-2.947,P=0.008)是早期死亡发生的独立危险因素。进一步分析发现，其中98名早期死亡的患者肺癌分子表型为EGFR/ALK野生型，其早期死亡率的风险比是EGFR突变/ALK重排患者的5.934倍。最后，亚组分析表明VTE事件的发生是EGFR/ALK野生型患者早期死亡的重要危险因素(矫正后的HR:1.682;95％CI:1.023-2.768,P=0.041)。 2、人源肺腺癌细胞株二代mRNA测序结果发现外源性凝血通路起始因子-组织因子(Tissue Factor,TF)表达水平与EML4-ALK融合蛋白磷酸化程度密切相关;并且EML4-ALK阳性肺腺癌组织及细胞系中均发现TF高表达，细胞培养上清的凝血时间也明显短于其他TF低表达肺癌细胞系。同时在人源肺腺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型中，相应高表达TF蛋白的EML4-ALK阳性肺癌细胞H2228移植瘤小鼠外周循环中也可检测到肿瘤源性TF,且在下腔静脉结扎模型中的矫正后的血栓重量最大。mRNA测序结果结合KEGG的PATHWAY数据库筛选出pERK1/2/AP-1通路可能参与EML4-ALK融合蛋白调控TF的表达，验证EML4-ALK融合蛋白靶向抑制的细胞也发现pERK1/2及AP-1表达也相应降低，进一步予ERK1/2抑制剂SCH772984或AP-1抑制剂T-5224处理EML4-ALK阳性肺癌细胞，均发现TF表达相应下降。 研究结论： 1、在如今靶向药物治疗时代，EGFR基因突变/ALK基因重排的患者早期死亡风险显著降低;然而，VTE仍然是转移性NSCLC患者早期死亡的重要危险因素，尤其是对于EGFR/ALK基因野生型的患者。 2、EML4-ALK融合蛋白可能通过pERK1/2/AP-1分子通路调控凝血因子TF表达，进而引起血液高凝，促进肺癌相关VTE的发生。
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