摘要
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是严重影响人类生命健康的恶性肿瘤，据调查数据显示，2021年CRC在全球的发病率和死亡率分别高居第三和第二位。CRC的发病机制除了与遗传以及环境因素有关，生活方式及其饮食习惯也可增加结直肠癌的患病风险。同时高胆固醇血症与CRC患病风险增加相关，但其具体分子机制仍未完全阐明。因此，通过改变饮食和生活方式可在一定程度上降低CRC的患病风险。 肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)由肿瘤细胞以及周围其他免疫细胞等组成，具有低氧、低PH、代谢物累积、营养耗竭等特点。肿瘤细胞与TME之间的相互作用能够决定肿瘤的进展和命运：肿瘤细胞通过促进肿瘤血管生成、释放细胞外分子、诱导免疫耐受等方式塑造有利于自身生存和发展TME;TME被认为是肿瘤细胞生长的沃土，通常为肿瘤的发展以及转移提供条件。 肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，通过多种途径参与肿瘤的进展。巨噬细胞在不同的环境中可以极化为不同的表型，从而形成具有不同功能特征的亚群，主要包括M1型和M2型巨噬细胞。一般认为，M1型巨噬细胞主要发挥促进炎症、杀菌及吞噬等防御作用;而M2型巨噬细胞主要通过分泌抗炎因子抑制免疫反应，在促进肿瘤生长、侵袭和转移中起作用。且高水平的M2型TAM浸润与肿瘤的不良预后显著相关。基于TAM在肿瘤进展中的重要作用，TAM已成为肿瘤治疗的潜在靶点，然而，巨噬细胞在CRC肿瘤微环境中向M2型极化的分子机制还未完全明确。 现已证实，多种类型的肿瘤细胞都表现出胆固醇生物合成相关基因的异常高表达和胆固醇合成的增多。甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA pathway)是胆固醇生物合成的主要途径，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶1(HMGCS1)是该途径中的一个重要调控节点。癌症基因组学数据显示，HMGCS1在胃癌、乳腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤中表达上调并伴有胆固醇生物合成的异常增多，并与患者的不良预后和较低的生存率相关。本课题组前期研究发现，高表达HMGCS1可促进CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。鉴于HMGCS1在胆固醇生物合成过程中的重要作用，本研究探讨了 CRC肿瘤微环境中M2型巨噬细胞极化的具体机制。 本研究利用培养CRC细胞，使用基因敲降、细胞生物学功能检测，结合临床CRC组织标本检测、肿瘤数据库生物信息学分析，深入探讨了高表达HMGCS1的CRC细胞诱导M2型巨噬细胞极化的机制。 主要研究结果如下： 1、HMGCS1在CRC组织以及CRC细胞系中高表达，且与CRC的恶性程度成正相关。 2、胆固醇在CRC组织以及CRC细胞系中富集。CRC细胞系较正常结肠上皮NCM460释放更多的胆固醇至培养基中，然而敲降基因HMGCS1后胆固醇合成减少。 3、将CRC细胞与巨噬细胞共培养，M2型巨噬细胞的比例随共培养时间的延长逐渐增高;而M1型巨噬细胞的比例显著减少、合成分泌的细胞因子亦明显降低;结合临床组织标本PCR以及免疫组化染色结果同样显示M2型巨噬细胞在CRC组织内增多。表明CRC细胞可促进巨噬细胞向M2型极化。 4、在巨噬细胞培养基中加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),M2型巨噬细胞合成分泌的细胞因子显著增高，表明胆固醇具有促进巨噬细胞向M2型极化的作用;添加甲基-β-环糊精(M-β-CD)将上清中的胆固醇快速消耗后，巨噬细胞则向M1极化，表明CRC细胞可通过释放胆固醇加速周围巨噬细胞向M2型极化。 5、将敲降HMGCS1的CRC细胞与巨噬细胞共培养，M2型巨噬细胞的比例显著低于对照组，IL-10和CCL18的含量亦明显减少，提示CRC合成释放胆固醇减少后阻碍了巨噬细胞向M2型极化。 6、胆固醇可以通过外泌体的形式被巨噬细胞摄取，且CRC细胞分泌的外泌体中的胆固醇含量明显高于正常结肠上皮NCM460细胞。 7、肿瘤来源的外泌体可促进巨噬细胞向M2型极化，中和抗体封闭CD36后M2型巨噬细胞相关细胞因子比例降低。 8、将巨噬细胞定向极化为M2型后与CRC细胞共培养，发现CRC细胞凋亡减少而增殖速度加快，表明CRC细胞诱导M2巨噬细胞的极化有助于CRC的恶性进展。 综上，本研究结果表明高表达HMGCS1的CRC细胞可合成大量的胆固醇，并可以通过外泌体的形式将胆固醇释放到细胞外，继而被肿瘤微环境中的巨噬细胞吞噬，吞噬胆固醇的巨噬细胞向M2型极化。M2型巨噬细胞合成分泌多种促肿瘤因子，加速了 CRC细胞的恶性进展。该研究为靶向M2型巨噬细胞治疗策略以及HMGCS1诱导CRC肿瘤微环境中M2型巨噬细胞极化的作用机制提供了新的思路和实验依据。
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