摘要
帕金森病(Parkinson''s disease;PD)是一种神经退行性疾病，以黑质致密部(SNpc)多巴胺能神经元丢失为主要特征。其典型的病理表现是神经元内存在路易氏体(Lewy bodies;LBs)，主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein;α-syn)。SNCA编码α-syn,在常染色体显性遗传性PD中常见的有三种错义点突变(A53T,A30P和E46K)。其中A53T突变是最早发现的导致家族性PD的突变位点。α-syn在细胞内发挥多种功能。野生型或家族突变型α-syn过表达均被证明会损伤细胞内的多个生理过程。上述所说的病理生理过程都涉及内质网和线粒体之间的信号传导。线粒体表面积的5-20％与ER膜紧密连接，这些区域称为线粒体相关内质网膜(Mitochondrial associated membrane;MAM)。大量证据表明，线粒体通过MAM直接与ER进行物质信息交换。调节细胞基本代谢活动。其中包括Ca2+稳态，线粒体ATP的产生，线粒体融合分裂，未折叠蛋白反应(UPR)等。因此，研究α-syn对MAM的损伤有可能解释帕金森病的多种损伤机制。 本课题通过细胞实验以及动物实验来研究α-syn/A53T对于MAM的结构功能的影响，并进一步探讨损伤MAM的机制。 为了研究过表达α-syn/A53T蛋白对于MAM数量的影响，我们使用SH-SY5Y细胞系过表达α-syn/A53T突变体，以及A53T转基因小鼠培养的原代神经元，通过PLA的方法标记细胞内MAM的数量。在电镜下观察A53T小鼠黑质中MAM的数量。以上实验结果均表明α-syn/A53T突变体会导致MAM数量下降。我们进一步检测了 α-syn/A53T对MAM功能的影响。MAM的主要功能是由内质网向线粒体转运钙离子，因此我们检测了 MAM的钙离子转运功能。 结果表明，α-syn/A53T组线粒体钙离子峰值降低。IP3R-GRP75-VDAC复合物是MAM中重要钙离子钙通道，其功能受损可能是MAM钙离子转运功能受损的原因，因此，向SH-SY5Y细胞中过表达α-syn/A53T通过 Western blot(WB)实验检测GRP75的含量，结果显示GRP75含量显著下降。同时我们还使用过表达α-syn/A53T的转基因小鼠，提取中脑部位的蛋白质，WB实验检测GRP75的含量，结果显示GRP75含量也显著下降。同时，我们还检测了钙通道复合物中VDAC的含量，并无显著性差异。由于线粒体内的大量的生物反应过程需要钙离子的参与。因此我们检测了表征与钙离子相关的线粒体结构与功能指标。使用线粒体复合物Ⅰ试剂盒检测其活力，细胞过表达α-syn/A53T以后线粒体复合物Ⅰ的活力下降。使用JC-1检测线粒体的膜电势，细胞过表达α-syn/A53T以后线粒体膜电势下降，说明线粒体呼吸链损伤。为了检测线粒体形态结构，使用mito-tracker标记线粒体，结果显示过表达α-syn/A53T组线粒体碎片化。由以上结果可以推测α-syn/A53T导致的MAM损伤以及由其引发的线粒体功能异常，造成了严重的细胞损伤。 我们又进一步研究了 MAM损伤的机制。由于MAM是内质网与线粒体连接的重要位点，内质网的形态结构以及线粒体的数量可能会影响MAM的数量，因此我们进一步观察了内质网形态以及线粒体的数量。我们使用COS7细胞和U2OS细胞，向细胞中转染RFP-N1-Sec61β标记内质网形态，同时转染EGFP-N1-α-syn/A53T等质粒。实验结果表明细胞过表达α-syn/A53T以后观察到细胞的管状内质网与片层内质网的比值下降，并且在细胞内主要是管状内质网与其他细胞器相互作用。不仅如此，我们在细胞内还发现了一种结构称为ER-Whorls。为了进一步观察ER-Whorls的立体结构，对细胞中的ER-whorls片层扫描结果进行三维成像，结果显示ER-Whorls是细胞内的泡状结构，同时在TG小鼠黑质部位神经元胞体电镜图片中也发现该结构。为了验证α-syn/A53T和ER-Whorls产生的关系，我们对含有ER-Whorls的细胞数量进行统计，结果表明α-syn/A53T组ER-Whorls的细胞数显著增加。通过WB实验检测转染α-syn/A53T以后可导致内质网应激标记蛋白BIP的含量增加，以上结果表明ER-Whorls的产生与内质网应激关系紧密。为了排除线粒体数量对于MAM数量的影响，通过WB实验检测了线粒体的标记蛋白TOM20以及COX Ⅳ的含量，结果表明其含量没有显著的变化。为了进一步验证上述实验结果，小鼠黑质电镜图片中的线粒体进行统计，结果表明线粒体的数量也无显著性差异。 综上所述，本课题得出如下结论，α-syn/A53T突变体可以损伤 MAM的结构以及功能。α-syn/A53T突变体对于内质网结构的损伤可能是导致MAM损伤的原因之一。α-syn/A53T对于MAM损伤可以解释以往研究的多种病理性损伤。为α-syn/A53T导致神经毒性带来了新的见解，并揭示干预PD的新治疗靶标。
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