摘要
目的： 探讨调节性T细胞外泌体(rEXS)对血管内皮细胞迁移、管腔形成及紧密连接蛋白表达的影响，并通过动物实验观察其对受损的血视网膜屏障(BRB)的保护作用。推测调节性T细胞外泌体(rEXS)保护BRB的可能机制。 方法： 取C57BL/6小鼠脾脏，采用磁珠吸附分选调节性T细胞(Treg)。收集Treg细胞培养上清，Total Exosome Isolation Reagent提取调节性T细胞外泌体(rEXS),并通过western-blot检测CD63和TSG101的表达，利用生物透射电子显微镜分析(TEM)及粒径分析(NTA)共同鉴定提取的rEXS。脂多糖(LPS)(100 ng/ml)激活BV2小胶质细胞，不同浓度的rEXS(10、20和50μg/ml)处理活化的BV2小胶质细胞。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小胶质细胞白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)分泌水平。将BV2和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养，依据不同的刺激条件对细胞进行分组。通过管腔形成、transwell细胞迁移及细胞划痕实验检测各组HUVECs的管腔形成和迁移能力，比较分析rEXS对血管内皮细胞管腔形成和迁移能力的影响。Western blot、RT-PCR及免疫荧光染色检测各组内皮细胞ZO-1和occludin的表达水平。流式细胞仪分析检测rEXS对内皮细胞凋亡的影响。Transwell检测各组血管内皮细胞渗透性。将db/db鼠作为糖尿病动物模型，对糖尿病鼠的视网膜病变进行研究。依据不同的处理方法将小鼠分为正常对照组(Control),糖尿病组(DR)和rEXS组。采用酶联免疫吸附法检测各组小鼠房水中TNF-α和IL-1β的含量，评估rEXS对小鼠眼内炎症因子表达的影响。Western blot检测rEXS对db/db小鼠视网膜组织紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达的影响。视网膜铺片行Lectin染色，荧光显微镜下拍照，图片经软件分析测量视网膜无灌注区和新生血管区的面积，比较分析rEXS对糖尿病小鼠视网膜新生血管及无灌注区面积大小的影响。最后对rEXS组小鼠的眼球切片进行染色，评估rEXS用于治疗血视网膜屏障损伤的安全性。 结果： Western blot检测结果显示rEXS中CD63和TSG101蛋白均呈阳性表达，透射电镜下观察，rEXS呈圆形或类圆形，直径分布在50～150 nm范围内。rEXS处理后的小胶质细胞，IL-1β、TNF-α分泌水平随rEXS剂量的增加而显著降低(PIL-1β＜0.0001;PTNF-α=0.02),IL-10分泌水平在rEXS处理的小胶质细胞中显著升高(P=0.02)。经LPS活化的BV2细胞培养上清孵育的HUVEC，管腔形成和迁移分别为263±13和380±28,而经rEXS处理的BV2细胞培养上清孵育的HUVEC,管腔形成和迁移分别为182±11和225±26,两者比较，有统计学差异(P＜0.0001)。Western blot,RT-PCR检测内皮细胞紧密连接蛋白表达，结果发现HUVEC与活化的BV2共培养时，ZO-1和occludin表达水平降低，而在共培养体系中加入rEXS后，两种紧密连接蛋白的表达水平升高(P＜0.0001)。共培养条件下，内皮细胞经免疫荧光染色后发现，LPS活化的BV2,可破坏HUVEC的紧密连接，细胞之间的紧密连接连续性破坏，紧密连接蛋白表达稀疏;rEXS使紧密连接蛋白表达增多，细胞之间紧密连接结构部分恢复。LPS活化的BV2与HUVEC共培养后，流式细胞仪检测HUVEC凋亡率为7.10％+1.46％(早期凋亡+晚期凋亡)，rEXS干预后的HUVEC凋亡率为3.87％+1.29％(早期凋亡+晚期凋亡)，两者比较无明显差异，rEXS对血管内皮细胞没有明显的抗凋亡的作用。经LPS活化的BV2细胞培养上清处理的HUVEC,其荧光素的渗漏增加，而rEXS可明显减少荧光素的渗漏(P＜0.0001)。ELISA房水检测数据显示正常对照组小鼠房水中TNF-α和IL-1β含量分别为(40.12±3.31)pg/ml和(20.15±2.13)pg/ml,DR组小鼠两种细胞因子含量升高，分别为(140.23±4.51)pg/ml和(70.34±5.24)pg/ml,rEXS组小鼠房水中，TNF-α和IL-1β含量分别为(102.33±2.34)pg/ml 和(33.26±2.33)pg/ml,分泌明显低于 DR 组(P＜0.0001)。视网膜组织中紧密连接蛋白表达结果如下：与正常对照组比较，DR组小鼠视网膜组织中 ZO-1 和 occludin 表达减少(PZO-1＜0.0001,Poccludin＜0.001);与 DR 组比较，rEXS组两种紧密连接蛋白的表达升高(PZO-1＜0.0001，Poccludin＜0.01)。视网膜铺片经Lectin染色，荧光显微镜下拍照，图片经软件分析后表明：正常对照组小鼠视网膜血管走行正常，无迂曲扩张，无明显的无灌注区及新生血管。DR组和rEXS组小鼠视网膜存在较大面积的无灌注区，中周部可见新生血管，两组无灌注区的面积比分别为：DR组(17.32±1.03)％，rEXS组(5.24±1.32)％,rEXS组较DR组无灌注区面积减小(P＜0.01),两组新生血管面积比分别为：DR 组(4.31±0.32)％，rEXS 组(2.14±0.43)％,rEXS 组新生血管面积较 DR组减少，统计学上有明显差异(P＜0.01)。db/db小鼠玻璃体腔注射rEXS后一周，摘除小鼠的内脏，经HE染色后，各内脏组织结构清晰，细胞核无肿大，细胞间质未见异常结构。说明玻璃体腔注射rEXS治疗血视网膜屏障损伤，具有一定的安全性。 结论： rEXS能够抑制db/db糖尿病小鼠视网膜新生血管的形成，减轻视网膜渗漏，减少视网膜无灌注区的形成。其机制可能是rEXS具有调控眼内炎症效应分子TNF-α和IL-1β的表达的能力，从而影响下游某些信号分子的表达，并上调视网膜组织紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达，起到保护血视网膜屏障的作用。
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