摘要
背景： 肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类健康，是全球肿瘤相关死亡的主要原因。2023年，预计美国每天有350人死于肺癌。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌患者总数的80-85％，主要包括肺腺癌和肺鳞癌。虽然近年来肺癌的诊断和治疗技术取得长足进步，但晚期非小细胞肺癌病人的5年生存率仍然仅为23％。为此，迫切需要深入研究调控NSCLC发生发展新分子、揭示其作用新机制，为临床NSCLC的干预和治疗提供新靶点、新策略以延长肺癌患者的生存期，提高其生活质量。 同源盒C9(HOXC9)是HOX家族重要成员之一，在多种癌组织中表达异常，其表达异常程度与恶性程度密切相关。例如，在乳腺癌MDA-MB-231和MCF7等细胞系中，HOXC9过表达可降低肿瘤细胞的增殖能力，但是提高乳腺癌细胞的侵袭性。除乳腺癌外，还发现HOXC9基因是一种新的胃癌致病基因。HOXC9在胃癌组织中表达水平显著增加，这可能会导致不良的预后结果。尽管已发现HOXC9在多种恶性肿瘤中的重要作用，但是HOXC9是否参与非小细胞肺癌的发生和发展？在NSCLC的发生发展中，HOXC9的作用机制怎样？这些问题目前尚不清楚。 本研究从生物信息学分析和实验验证相结合的角度出发，探索非小细胞肺癌中HOXC9的作用及分子机制。检测HOXC9在NSCLC临床标本中的表达变化情况;采用构建靶向HOXC9的siRNA敲除载体质粒，检测HOXC9敲除对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响，包括细胞增殖、迁移和侵袭;并了解其可能的分子调控机制。本研究可能为非小细胞肺癌的诊断和治疗提出新的角度和方法。 方法： 1.HOXC9在非小细胞肺癌中的表达和临床意义 通过公共数据库探索HOXC9在NSCLC中的基因表达、临床预后、免疫浸润情况。然后通过RT-PCR和核酸电泳分析HOXC9在非小细胞肺癌与癌旁组织中的表达水平差异。从而发现HOXC9在非小细胞肺癌发生和发展过程中的临床意义。 2.HOXC9对非小细胞肺癌细胞生物学行为的作用 通过在体外实验中构建靶向HOXC9的siRNA敲除载体质粒，检测HOXC9敲除对NSCLC恶性生物学行为的影响，包括细胞增殖、迁移和侵袭。 3.HOXC9潜在上游调控基因的筛选及分子机制研究 我们使用ENCORI探索HOXC9上游调控ncRNA，筛选出最有潜力的上游miRNA和circRNA，从而发现新的HOXC9调控机制。 结果： 1.HOXC9在非小细胞肺癌中的表达情况及其临床应用价值 (1)15对NSCLC组织和癌旁组织的标本，通过RT-PCR和核酸电泳（琼脂糖凝胶电泳法）检测HOXC9的表达水平。与癌旁组织相比，非小细胞肺癌HOXC9表达水平明显升高。 (2)根据TIMER2.0数据库的结果，与正常组织相比，HOXC9在16种人类常见癌症中的mRNA表达变化情况不一致。在14种癌症类型中上调、2种癌症类型中显著性降低。随后，我们使用GEPIA2数据库进一步验证HOXC9在癌症中的表达水平。在11种癌症类型中上调、3种癌症类型中明显下调。 (3)使用GEPIA2的“病理阶段图”模块，评估Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期NSCLC患者中HOXC9表达水平，从而发现HOXC9表达与非小细胞肺癌病理阶段具有显著相关性(P=0.0313)。 (4)高表达HOXC9与肺腺癌的总体生存期(P=0.02)和无病生存期显著相关(P=0.047)。肺鳞癌中HOXC9表达水平和总体生存期(P=0.9)、无病生存期(P=0.21)无关。 (5)HOXC9与肺癌免疫微环境中多种免疫细胞浸润相关;并且在肺腺癌和鳞癌中，免疫细胞浸润种类不同。HOXC9可能调节免疫细胞的募集和激活，可能是一种重要的免疫细胞浸润调节因子。 2.HOXC9对非小细胞肺癌生物学行为的作用 (1)通过CCK8细胞增殖试验，发现干扰HOXC9表达，非小细胞肺癌细胞增殖活性在12、24、36、48和60小时显著下降。HOXC9可能促进NSCLC细胞的增殖。 (2)通过Transwell实验以评估HOXC9敲除A549和SK-MES-1细胞的迁移速度。与si-con组相比，HOXC9敲除细胞的迁移速度显著降低。此外，Matrigel侵袭试验的结果表明:与对照组相比，si-HOXC9组的细胞渗透基质胶的能力降低，侵袭细胞数量显著下降，从而导致A549和SK-MES-1细胞的侵袭能力明显减弱。 3.HOXC9潜在上游调控基因的筛选 在肺腺癌中circ CENPF/hsa-miR-184轴可以作为HOXC9最有潜力的上游调控通路。 结论： 我们阐明HOXC9在多种类型的人类癌症(包括NSCLC)表达水平，并与肺腺癌的不良预后相关。HOXC9可能通过免疫细胞浸润发挥致癌作用。此外，我们还确定了肺腺癌中HOXC9的上游调控机制，即circ CENPF/hsa-miR-184/HOXC9轴。我们下一步的实验研究将有助于验证我们的发现并更好地理解HOXC9的致癌机制。
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