目的： 脂肪酸是细胞膜脂和信号分子的重要组成部分，是能量代谢的重要底物。肿瘤细胞的能量代谢机制与正常细胞不同，其生长和增殖所需的脂肪酸主要来自从头合成，因此与脂肪酸合成相关的酶在肿瘤细胞中表达异常。脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)和乙酰辅酶 A 羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是脂肪酸合成过程中的关键酶，因此抑制FASN和ACC成为肿瘤治疗重要的研究方向。 在之前的研究中，我们系统地探索参与脂肪酸合成的酶在肿瘤细胞中的作用。并得到结论，相对于FASN，ACC1在肿瘤生长增殖过程中发挥了更加重要的作用;敲除ACC1/2后抑制肿瘤生长原因是抑制了超长链脂肪酸的合成;ACC-DKO细胞在脱脂血清中无法生长。本研究主要探索脂质缺乏导致细胞死亡的原因。 方法： 1.使用CRISPR/Cas9技术敲除MDA-MB-231以及HeLa细胞中脂肪酸合成相关基因FASN、ACC1、ACC2,以及敲除与鞘磷脂合成有关基因SPTLC1,构建基因敲除细胞。 2.细胞生长计数实验，观察基因敲除和过表达后，细胞的生长状况，以及加药处理后，对肿瘤细胞的营救作用。 3.通过流式分析，观察敲除FASN、ACC后，对细胞中ROS水平、细胞膜电位、细胞凋亡的影响。 4.通过Western blot实验，检测敲除ACC1/2后，MDA-MB-231以及HeLa细胞中与凋亡有关蛋白的表达情况;检测过表达Bcl-2、Bcl-xL后，细胞中相关蛋白的表达情况。 5.使用共聚焦激光扫描显微镜观察MDA-MB-231以及HeLa细胞活细胞线粒体形态，以及敲除基因ACC1/2后对线粒体形态的影响。 6.通过Transwell侵袭实验，观察FASN、ACC1、ACC2基因敲除后对细胞侵袭能力的影响。 7.通过脂质代谢组学分析，ACC-DKO细胞线粒体中各种脂肪酸的含量与野生型细胞的差异。 结果： 1.使用不同种类细胞死亡方式的抑制剂来观察对ACC-DKO细胞的营救，发现细胞凋亡、铁死亡有关的抑制剂有很好的营救作用。 2.ACC-DKO细胞中ROS水平明显升高。 3.ACC-DKO 细胞在 H2O2(hydrogen peroxide.,H2O2)、PMS 的外源刺激下相对于野生型细胞更加敏感。 4.ACC-DKO细胞中线粒体膜电位明显降低。 5.在ACC-DKO细胞中，与凋亡有关的蛋白，PARP1、Caspase-3出现了剪切体，表明敲除ACC1/2导致细胞凋亡。 6.过表达对细胞凋亡有保护作用的蛋白Bcl-2、Bcl-xL,ACC-DKO细胞在脱脂血清中的存活率明显升高。 7.通过共聚焦激光扫描显微镜拍摄，发现在ACC-DKO细胞中，线粒体的形态受损，线粒体膜出现片段化。 8.脂质代谢组学分析显示，相对于野生型细胞，ACC-DKO细胞线粒体中二氢神经酰胺、神经酰胺和糖基神经酰胺等脂质的含量明显降低。 9.在ACC-DKO细胞中回补超长链脂肪酸后，线粒体的形态得到一定程度的恢复。 结论： 同时敲除基因ACC1、ACC2,导致MDA-MB-231以及HeLa细胞中超长链脂肪酸含量降低，如神经酰胺、二氢神经酰胺、和糖基神经酰胺，包括CerG3GNAC1、鞘磷脂、Hex1Cer、Hex2Cer、GM3、Hex3Ce、，由于这些脂质参与生物膜的构成，所以导致线粒体膜形态遭到破坏，从而导致线粒体功能的改变，如对超氧化物更敏感，细胞失去了维持氧化还原稳态的能力。因此超长链脂肪酸对于维持线粒体的形态结构和功能方面非常重要。
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