摘要
目的： 本课题旨在通过分析四逆散干预高脂饲料诱导的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)大鼠后肠道菌群结构的变化，结合网络药理预测四逆散调控NAFLD相关的作用机制——炎症和胆汁酸信号通路，并进行实验验证，从肠道菌群结构-炎症和胆汁酸信号通路-脂质代谢轴，揭示四逆散改善NAFLD的作用机制，部分阐明“肝病实脾”的现代生物学基础。 方法： 1.使用网络药理学方法预测探索四逆散治疗NAFLD的潜在靶点和机制:运用网络药理学方法，通过多个数据库和文献研究收集四逆散柴胡、枳实、白芍、甘草活性成分，并预测四味中药的对应靶点以及NAFLD疾病基因，建立蛋白-蛋白互作(protein-protein Interaction,PPI)网络。采用随机游走重启算法(random walk with restart,RWR)算法鉴定四逆散治疗NAFLD重要基因后构建成分-基因网络和PPI网络，最后对核心靶标进行路径富集分析，确定由肠道菌群结构改变导致NAFLD的重要信号通路—炎症和胆汁酸信号通路。 2.NAFLD大鼠模型构建:SPF级雄性Wistar大鼠27只，体重280-320g,采用高脂饲料诱导法建立NAFLD大鼠模型。 3.四逆散治疗NAFLD的疗效观察:每周记录大鼠体重。给予四逆散灌胃治疗4周后，采集大鼠血液及肝脏样本，观察各组大鼠肝脏形态，检测各组大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)、甘油三酯(total triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)等指标。通过苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、油红O染色评价肝组织病理变化，对各组大鼠肝内TC、TG进行定量检测。 4.Illumina 16S高通量测序平台分析各组大鼠肠道菌群的结构:取大鼠粪便，借助Illumina 16S高通量测序平台分析各组大鼠肠道菌群的结构。首先进行相似性分析(Analysis of similarities,ANOSIM),以判断分组是否合理。随后使用OTU分析、Venn图、Alpha多样性分析等方法评价四逆散对NAFLD大鼠肠道菌群结构的作用，并探索四逆散对介导炎症、胆汁酸代谢的细菌丰度的影响。 5.HE染色、免疫荧光法、Elisa法、液相色谱-质谱联用(liquid chromatograph mass spectrometer,LC/MS)、蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)等验证四逆散调控炎症和胆汁酸信号通路治疗NAFLD的潜在机制。 (1)分析四逆散对模型大鼠肠黏膜通透性、炎症反应及其信号通路JAK2/STAT3的影响:取大鼠结肠并作HE染色观察病理改变，免疫荧光法观察大鼠结肠紧密连接蛋白Occludin的分布与表达，采用鲎试剂法检测大鼠血清脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)浓度，酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)检测血清、肝脏的炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-1β、RAGE、AGEs水平，计算Spearman相关系数评价炎症因子与肠道菌群的相关性，最后使用WB法检测大鼠肝组织JAK2/STAT3的表达; (2)探究四逆散对模型大鼠胆汁酸结构改变，及下游FXR脂质代谢信号通路的影响:使用LC/MS检测各组大鼠胆汁酸的含量，根据胆汁酸的多种分类方法，探究四逆散对NAFLD大鼠胆汁酸池组成的影响，特别是菌群代谢产生的次级胆汁酸，和能够调控胆汁酸信号关键受体FXR的胆汁酸。然后计算Spearman相关系数评价FXR拮抗胆汁酸含量与肠道菌群的相关性，最后运用WB法，检测脂质代谢关键通路FXR/SHP/SREBP-1c的关键蛋白的表达，分析四逆散对模型大鼠胆汁酸结构变化所致的脂质代谢的影响。 (3)通过肠道菌群结构-LPS反应-炎症信号通路和肠道菌群结构-胆汁酸信号-脂质代谢信号通路轴，阐释四逆散治疗NAFLD的潜在机制和“肝病实脾”部分现代生物学基础。 结果： 1.蛋白质互作网络研究预测炎症和胆汁酸信号是四逆散治疗NAFLD的关键靶点1.1 LPS反应、STAT3信号等是四逆散干预炎症的重要相关靶点 柴胡、白芍、枳实、甘草在靶点水平上具有潜在的协同作用;GO富集分析显示四逆散靶点和脂肪肝基因富集条目相似，包括了对LPS的应答在内的炎症反应进程，可见LPS反应是四逆散治疗NAFLD的重要炎症靶点;Glay算法鉴定出的6个PPI基因群之一与TNF信号通路和AGE-RAGE信号通路相关;通过RWR排序算法得到排名前十的hub基因，排在首位的是STAT3,表明STAT3可能也是四逆散治疗NAFLD的关键靶点。 1.2胆汁酸分泌信号通路是四逆散治疗NAFLD的潜在信号通路 KEGG富集分析显示，胆汁酸分泌通路是四逆散靶点、NAFLD靶点以及四逆散-NAFLD交集靶点的富集通路。 2.疗效观察发现四逆散对NAFLD大鼠模型具有较好的改善作用 在动物一般情况方面，NAFLD大鼠体型增大，毛色发黄，行动较迟缓，大便偏软，四逆散治疗能改善NAFLD大鼠毛色、体型、反应能力等一般情况指标;NAFLD大鼠体重较正常组显著升高(p＜0.01),治疗组大鼠在给药开始后，体重增长较模型组减慢，并在治疗第4周时四逆散组大鼠体重显著低于模型组(p＜0.05);模型组大鼠血清ALT、AST、FFA、TG、TC和LDL-C较正常组显著升高(p＜0.01)，HDL-C显著降低(p＜0.01),四逆散可有效降低NAFLD大鼠血清 ALT、AST、FFA、TG 和 LDL-C 水平(p＜0.01),提高 HDL-C 水平(p＜0.01);从肝脏形态上看，正常组大鼠肝脏呈暗红色，表面光滑，边缘锐利，质软且有弹性，模型组大鼠肝脏肿大，呈明显黄色，触之质韧，有油腻感，而经四逆散治疗后色泽较模型组红润，表面脂肪颗粒减少;在病理方面，模型组大鼠肝细胞变形，排列紊乱，可见明显的脂质空泡，另外可见炎性细胞浸润;四逆散治疗组肝细胞形态较模型组明显改善，脂质沉积减少;对各组大鼠肝内TC、TG的定量分析发现，与正常组相比，模型组肝内TC、TG含量显著升高，而四逆散干预后，二者含量均较模型组显著降低(p＜0.01)。 3.四逆散可能通过改善肠道菌群结构发挥治疗NAFLD的作用 ANOSIM结果显示本实验组间差异大于组内差异，分组具有意义;多样性分析中，模型组大鼠菌群PD、Sobs、Chao1指数较正常组显著降低（p＜0.01），说明NAFLD大鼠菌群的丰度和多样性减退，而四逆散可以改善NAFLD大鼠肠道菌群的丰度和多样性，表现为能够显著提升NAFLD大鼠的Shannon、PD、Sobs、Chao1指数（p＜0.05）;多级别下大鼠肠道菌群结构分析显示，模型组菌群结构较正常组发生了明显的变化，而四逆散可以改善其中部分菌群的比例，包括降低厚壁菌门、梭状芽孢杆菌纲、瘤胃球菌科相对丰度，提高拟杆菌门、S24-27科和阿克曼菌属的相对丰度;从与血清学检测指标的相关性分析中来看，萨特氏菌属、葡萄球菌属、多尔氏菌属、费克蓝姆菌属等与TC、LDL-C、TG、INS呈正相关，与AST、ALT呈正相关;AF-12属、苏黎世菌属、Butyricimonas属等细菌的丰度与HDL-C呈正相关，与TC、LDL-C、TG、INS、AST和ALT呈负相关，被认为是有益菌。四逆散除能够降低NAFLD大鼠菌群结构改变引起LPS释放增加外，对胆汁酸代谢相关菌群也会产生影响，表现为显著降低NAFLD大鼠梭菌、乳酸杆菌和芽孢杆菌的比例（p＜0.05）。 结论： 1.网络药理学研究揭示LPS反应和STAT3可能是四逆散治疗NAFLD关键靶点，并且可能与炎症的调节有关;胆汁酸分泌信号通路是四逆散治疗NAFLD的潜在途径。 2.四逆散对NAFLD大鼠的肝细胞损伤及脂质代谢具有改善作用。 3.四逆散能改善模型大鼠肠道菌群结构紊乱，降低菌群结构失调导致的LPS释放增加，降低具有BSH活性的细菌的丰度。 4.分子水平研究表明，（1）四逆散能可能通过调控炎症相关JAK2/STAT3信号通路发挥对大鼠NAFLD的治疗作用。（2）四逆散可能通过调控脂质代谢相关的FXR/SHP/SREBP-1c信号通路发挥对大鼠NAFLD的治疗作用。 5.调控肠道菌群结构-炎症和胆汁酸信号通路-脂质代谢轴，是“肝病实脾”法治疗NAFLD的部分现代生物学基础。
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