摘要
长链非编码RNA（lncRNAs，长度超过200个核苷酸）在各种细胞和生理过程（如细胞分化、基因印记、转录干扰和组蛋白修饰）中充当基因表达的关键调控因子。lncRNA表达失调可能影响抑癌途径，从而诱导多种恶性肿瘤的发生、发展和转移。特别地，lncRNA相比于蛋白编码基因，其表达呈现出显著的组织和细胞类型特异性。此外，肿瘤衍生的lncRNAs可稳定存在于多种生物基质（例如，血液和尿液）中，并对RNase具有良好的抗性。LncRNA被认为是早期癌症诊断、肿瘤分型和预后评估的理想生物标志物。尽管目前已开发出许多用于 lncRNAs 检测的方法（例如，微阵列和 RNA 测序），但它们由于成本高、样本消耗量大、分析性能不足等缺陷，大多数策略的临床应用受到限制。因此，亟需开发能用于检测复杂临床样本和单细胞中的lncRNA的新检测方法。 在本论文中，通过将核酸扩增策略（即无酶扩增和酶辅助的扩增）与纳米材料（即金纳米颗粒和量子点）相结合，本论文开发了一系列荧光生物传感器用于检测癌细胞和临床组织中lncRNA。本论文的主要内容如下： 1．构建了一种基于四面体框架核酸驱动的滚环扩增（RCA）的新型单分子荧光生物传感器，用于检测癌细胞和临床组织中的lncRNA。靶标lncRNA起着“桥梁”的作用，将组装在磁珠（MB）表面的捕获探针与DNA四面体连接起来，从而在MB表面形成捕获探针-lncRNA MALAT1-DNA 四面体夹心结构。磁分离后，加入环状模板激活 phi29 DNA 聚合酶辅助的滚环扩增反应，产生长单链DNA产物。随后，信号探针与生成的RCA产物结合，激活脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（APE1）介导的信号探针循环水解，释放出丰富的Cy5分子。值得注意的是，这种生物传感器所涉及的级联信号放大过程能以一步方式快速完成（40分钟内），大大简化了检测程序。该生物传感器能够灵敏地定量 lncRNA，检测限为 16.33 aM，并且具有高特异性和良好的抗干扰性能。它能以单细胞灵敏度量化细胞的lncRNA水平，以及区分肿瘤细胞和正常细胞。此外，它能区分 lncRNA MALAT1 在乳腺癌组织和健康癌旁组织中的表达，在lncRNA相关的临床诊断和治疗方面具有广阔前景。 2. 展示了一步自组装基于量子点（QD）的球形核酸（SNA）纳米结构，用于精确监测细胞和临床组织中的lncRNA。当靶lncRNA存在时，它与哑铃探针结合以暴露Cy5标记的引物的互补结构域，其随后诱导级联引物交换反应以产生丰富的Cy5标记的引发剂。Cy5标记的引发剂随后与QD表面上的发夹探针杂交，以激活等温循环链置换聚合反应，产生QD-DNA-Cy5 纳米结构并诱导供体 QD 和受体 Cy5 之间的有效 F?rster 共振能量转移（FRET）。所获得的 FRET 信号通过单分子成像准确定量。值得注意的是，基于单个 QD的SNA纳米结构不仅作为信号发射器，还能作为防止非特异性扩增的保护器。此外，这种QD纳米传感器仅雇佣一种DNA聚合酶就可实现两级扩增，避免了多种酶的精心调制。该QD 纳米传感器的自组装可以在室温下以单步单管方式完成，消除了精确的温度控制和繁琐的反应方案。该 QD 纳米传感器实现了高灵敏度检测，检测限为 65.25 aM。此外，它能够在单细胞水平上量化lncRNA的表达，区分恶性肿瘤细胞和健康细胞，以及区分乳腺癌患者和健康个体，为生物医学研究和早期临床诊断提供了范例。 3. 通过将适配体功能化的 DNA 四面体纳米探针与基于金纳米颗粒（AuNPs）的球形核酸纳米结构相结合，开发了一种双色编码的DNA纳米机器用于同时成像多个lncRNAs。在 lncRNA MALAT1 和 lncRNA HOTAIR 存在的情况下，初始锁定的 DNAzymes 1 和 2 通过lncRNAs与适配体功能化DNA四面体纳米探针的locker链杂交可以被特异性激活，并折叠成具有催化活性的构象。适配体功能化的 DNA 四面体纳米探针上激活的 DNAzymes 1和2可以分别与组装在AuNPs表面的Cy5/Cy3修饰的报告探针1和2杂交，诱导报告探针的循环切割，以从AuNPs上释放大量Cy5和Cy3分子。由于AS1411适配体和核仁素的特异性识别，DNA四面体纳米探针可以特异性地内化到癌细胞中。报告探针1/2@AuNPs纳米结构也能在不借助任何外源转染剂的情况下主动进入细胞。该 DNA 纳米机器具有高特异性，可以区分正常组织和癌症组织中的 lncRNA MALAT1 和 lncRNA HOTAIR 水平。此外，该 DNA 纳米机器能够以高精度和高可靠性可视化活细胞中的 lncRNA MALAT1 和lncRNA HOTAIR，并可以区分癌细胞和正常细胞，为细胞成像和早期精确的癌症诊断提供了一个有前途的平台。 4. 通过将四面体 DNA 纳米结构与基于 QD 的球形核酸纳米结构相结合，构建了一种用于lncRNA成像和lncRNA激活的基因沉默的DNA纳米机器。具体而言，四面体DNA纳米结构由两个功能性组件组成，包括一个含治疗性 DNAzyme 的 DNA 三链体用于熵驱动DNA催化（EDC）扩增和一个适配体修饰DNA四面体框架用于靶向递送EDC扩增元件。靶lncRNA可以作为催化剂启动四面体DNA纳米结构和燃料链功能化QD之间的EDC扩增，诱导丰富的QD-DNA-Cy5三明治结构的产生和DNAzyme的解锁，产生放大的FRET信号。随后，活化的DNAzyme可以特异性识别和切割早期生长反应因子1（EGR-1）mRNA，实现基因沉默。该 DNA 纳米机器具有高特异性和高灵敏度，并已成功应用于乳腺癌组织中lncRNA水平的检测。此外，这种DNA纳米机器可以用于对活细胞中的低丰度lncRNA成像，甚至可以区分正常细胞和癌细胞。同时，它对EGR-1基因表现出优异的癌细胞靶向基因沉默，甚至选择性地杀死癌症细胞。因此，这种 DNA 纳米机器为体外诊断、细胞成像和靶向基因沉默提供了一个可编程的纳米平台。
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