不同应激大鼠CeA-DVC通路星形胶质细胞与神经元互作关系研究

李亚宸¹

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作者信息

1. 山东师范大学
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摘要

束缚-浸水应激（restraint water-immersion stress，RWIS）是一种兼有生理和心理因素的复合应激，常表现出胃黏膜层的糜烂、出血或溃疡等现象。束缚应激（restraint stress， RS）是一种非损伤性的心理应激，可导致胃排空延迟以及胃收缩增强等胃功能障碍，因此上述两种模型被广泛应用于应激引起的胃肠功能障碍的发生机制的研究中。中央杏仁核（central nucleus of amygdala，CeA）被认为是维持胃黏膜完整性的关键结构之一，已被证实参与恐惧获得和巩固、焦虑抑郁等多种行为调控，且有研究表明CeA在参与心理性以及生理和心理复合应激过程中可能存在不同的调控机制。课题组前期研究发现应激致功能性胃肠疾病主要是副交感神经活动加强所致，延髓初级胃肠中枢-迷走复合体（dorsal vagal complex，DVC）中的迷走神经背核（dorsal motor nucleus of the vagus，DMV）和孤束核（nucleus of solitary，NTS）在RWIS和RS两种应激模式下的神经元Fos表达不同程度的增强。CeA直接向DVC发送纤维投射，且有研究发现CeA-DVC通路可能参与RS条件下胃运动障碍的调节，说明CeA-DVC通路参与和情绪相关的胃功能调控。目前已发现RWIS大鼠NTS和DMV星形胶质细胞可通过调节神经元的激活参与胃功能的调控。那么CeA-DVC通路星形胶质细胞是否参与两种应激过程，以及该通路星形胶质细胞和神经元在参与生理性、心理性应激致胃功能障碍的过程中的相互作用特性如何？这些问题尚不清楚。基于此，本研究主要通过免疫组织化学法、Western Bloting、胃黏膜损伤评估、胃组织切片和苏木素-伊红染色等实验技术开展了以下三个实验：实验一用免疫组织化学法分析不同应激过程中CeA-DVC通路星形胶质细胞和神经元激活情况；Western Bloting比较不同应激过程中胃神经元活性差异；胃溃疡指数统计、胃组织切片和Western Bloting技术比较胃黏膜损伤程度。实验二和实验三通过脑立体定位和病毒微量注射技术分别抑制CeA星形胶质细胞和GABA能神经元的活性后，免疫组织化学技术比较不同应激大鼠NTS和DMV不同区段星形胶质细胞和神经元的活性变化；通过与实验一相同的实验方法观察比较不同应激过程胃神经元活性和胃黏膜损伤情况的差异。本研究取得的实验结果如下： 1. RWIS和RS大鼠CeA-DVC通路星形胶质细胞参与应激反应将大鼠随机分为对照组、束缚-浸水应激 3h（RWIS 3h）组和束缚应激 3h（RS 3h）组。结果发现， RWIS大鼠中央杏仁核内侧亚核（ medial division of the central amygdal nucleus，CeM）和中央杏仁核外侧亚核（lateral division of the central amygdal nucleus，CeL） GFAP表达显著升高（P＜0.01），而RS大鼠仅CeL中的GFAP表达显著升高（P＜0.01），表明RWIS大鼠CeL和CeM星形胶质细胞被激活参与RWIS过程，而RS大鼠CeL星形胶质细胞被激活参与RS过程，说明CeA星形胶质细胞在参与不同应激过程中可能存在不同的调控机制。在RWIS过程中，大鼠NTS和DMV吻、中和尾段GFAP、p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），胃内p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），胃溃疡指数显著升高（P＜0.01），Occludin、Claudin1、PCNA表达显著降低（P＜0.05），且胃切片观察到胃粘膜层上皮细胞明显的损伤，综上说明RWIS大鼠NTS和DMV各区段内星形胶质细胞和神经元以及胃神经元被激活，参与了RWIS致胃黏膜损伤的发生；在RS过程中，大鼠NTS中段GFAP、p-ERK1/2和c-Fos的表达显著升高（P＜0.05），DMV中段、尾段GFAP以及尾段p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），胃内p-ERK1/2和c-Fos表达略有升高，Occludin、Claudin1、PCNA表达显著降低（P＜0.05），胃切片仅观察到胃粘膜层上皮细胞间充血，综上说明RS大鼠NTS中段和DMV中段、尾段星形胶质细胞以及NTS中段、DMV尾段和胃的神经元被激活导致胃黏膜屏障功能轻度受损，综上表明不同应激大鼠CeA-DVC通路星形胶质细胞参与应激过程，且在胃功能的调节中可能发挥着不同的作用。 2. 抑制CeA星形胶质细胞后增强了DVC神经元的活性将大鼠随机分为GFAP-mCherry+CNO RS 3h和 RWIS 3h组、GFAP-hM4Di+Saline RS 3h和RWIS 3h组、GFAP-hM4Di+CNO RS 3h和RWIS 3h组6组。用化学遗传学中的DREADD技术抑制CeA星形胶质细胞后发现，RWIS大鼠NTS和DMV吻、中、尾段GFAP、p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），胃内p-ERK1/2、c-Fos表达和胃黏膜损伤指数显著升高（P＜0.01），胃粘膜层细胞损伤加重，胃内Occludin、Claudin1和PCNA表达显著降低（P＜0.05），说明抑制CeA星形胶质细胞后RWIS大鼠NTS和DMV不同区段神经元活性增强，可能介导了DVC星形胶质细胞活性的反应，胃神经元活性增强，胃黏膜损伤加重；RS大鼠DMV吻、中、尾段GFAP、p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），NTS吻、中、尾段GFAP，中段p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），胃内p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.01），Occludin、Claudin1表达降低，表明抑制CeA星形胶质细胞后RS大鼠NTS中段以及DMV各区段神经元活性增强，且可能介导了DVC星形胶质细胞活性的反应，胃神经元活性增强，胃黏膜屏障功能受损，进而表明胃黏膜损伤加重。 3. 抑制CeA内GABA能神经元后增强了DVC内神经元的活性大鼠随机分为空载病毒+CNO RS 3h和RWIS 3h组、（DIO+GAD65 CRE）+Saline RS 3h和RWIS 3h组、（DIO+GAD65 CRE）+CNO RS 3h和RWIS 3h组6组。用化学遗传学中的DREADD技术抑制CeA内GABA能神经元后发现，RWIS大鼠NTS和DMV吻、中、尾段GFAP、p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），胃内p-ERK1/2、c-Fos表达和胃黏膜损伤指数显著升高（P＜0.05），胃黏膜层细胞损伤加重，Occludin、Claudin1和PCNA表达显著降低（P＜0.05），综上说明抑制CeA内GABA能神经元后RWIS大鼠NTS和DMV不同区段神经元活性增强，同时可能通过调控星形胶质细胞活性加重了RWIS诱导的胃黏膜损伤；而RS大鼠NTS中、尾段GFAP，NTS中段c-Fos表达显著升高（P＜0.05）， DMV吻、中、尾段GFAP、p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），胃内p-ERK1/2和c-Fos表达显著升高（P＜0.05），其胃内神经元活性增强，胃粘膜层轻度损伤，胃内Occludin、Claudin1和PCNA表达降低，表明抑制CeA内GABA能神经元后RS大鼠NTS中段以及DMV各区段神经元的活性增强，同时可能通过调控NTS中段、尾段以及DMV各区段星形胶质细胞的活性进而导致胃黏膜屏障功能轻度受损，胃黏膜损伤加重。综上所述，RWIS大鼠CeM、CeL和DVC吻、中、尾段星形胶质细胞可能参与应激诱导的胃黏膜损伤，RS大鼠CeL和NTS中段、DMV中尾段星形胶质细胞在胃功能调控中发挥着重要作用。在RWIS和RS过程中，分别抑制CeA星形胶质细胞或GABA能神经元后，通过增强DVC神经元活性，且可能介导了星形胶质细胞的活性反应，加重了应激诱导的胃粘膜损伤。该研究进一步补充了不同种类应激致应激性胃功能障碍发生的中枢神经机制，同时对CeA-DVC通路中星形胶质细胞或者其与神经元相互作用的研究对进一步寻找临床上治疗应激性胃黏膜损伤等应激性胃功能障碍潜在的治疗靶点有重要意义。

关键词

胃肠功能障碍/束缚-浸水应激/束缚应激/中央杏仁核/延髓初级胃肠中枢-迷走复合体/星形胶质细胞/神经元/互作机制

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授予学位

硕士

学科专业

生物学;动物学

导师

赵东芹

学位年度

2024

学位授予单位

山东师范大学

语种

中文

中图分类号

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