摘要
禁食法诱导生理重塑是蛋鸡延养的常用方法之一，禁食作为诱导因素能够引起蛋鸡机体各机能发生重塑，其中羽毛脱落-新生的周期性变化是该过程中的突出性特征，故而俗称强制换羽。羽毛是家禽的重要表型特征之一，不仅反映家禽的生长及健康状态，而且影响其商品价值。羽毛的生长发育与毛囊密切相关，羽毛和毛囊的生长发育受环境、营养、激素和遗传等多种因素的影响。羽毛和毛囊均为动态器官，在禁食诱导生理重塑过程中羽毛表型变化明显，但具体变化和分子机制目前仍不清楚，值得我们进一步深入研究。为此，本试验选取96只320日龄体重均一健康的贵妃鸡母鸡，对其进行禁食诱导生理重塑。试验分为禁食期（Fast，F）和恢复期（Recovery，R），分别在禁食前一天（F0）、禁水禁食3天（F3）、禁食7天（F7）、禁食15天（F15）、恢复采食5天（R5）、恢复采食10天（R10）、恢复采食15天（R15）、恢复采食20天（R20）、恢复采食25天（R25）、恢复采食32天（R32）和恢复采食47天（R47）采集的羽毛、皮肤毛囊及血液样品，重点关注产蛋后期蛋鸡在禁食诱导生理重塑过程中羽毛和毛囊生长规律。并通过酶联免疫吸附试验检测激素变化、皮肤苏木精-伊红染色、毛孔性状和羽毛主要成分的测定，综合分析确定毛囊的关键变化节点，最终选取F0、F15、R5和R32四个时期皮肤毛囊进行转录组测序分析，寻找到与毛囊发育相关的候选基因和信号通路，发现甲状腺激素可能在禁食诱导过程中发挥重要作用。最后，通过在表皮毛囊干细胞培养基中添加和胚蛋注射四碘甲状腺原氨酸，探究了四碘甲状腺原氨酸对细胞、毛囊发育相关基因和毛囊性状的影响。主要结果如下： 试验一：禁食诱导生理重塑过程中鸡羽毛及毛囊变化的研究 1.羽毛的更换发生在禁食末期和恢复采食初期，从禁食第13天开始出现羽毛脱落情况，在恢复采食25天停止脱落。恢复采食第5-25天为主翼羽脱落和再生的关键时期。 2.孕酮和催产素在F15和在F7出现显著下调（P＜0.05）。糖皮质激素在恢复采食期间含量逐渐升高，R20和R25极显著高于R5（P＜0.01）。三碘甲状腺原氨酸和四碘甲状腺原氨酸在禁食期间和恢复采食初期均上升，R20时期达到显著水平（P＜0.01），R32已经降至禁食前。皮肤苏木精-伊红染色发现恢复采食5天时结构变化较大。 3.水分含量在禁食期间降低，F15显著低于各时期（P＜0.0.5)，恢复采食后升高，达到F0水平。粗蛋白禁食期间升高，F15时期极显著高于F0和R32时期（P＜0.01)，而后下降至F0水平。羽毛中的粗灰分和钙含量呈下降趋势，R32显著低于F0时期（P＜0.05）。 4.R5时期毛孔密度显著高于F15时期（P＜0.05），与F0时期差异极显著（P＜0.01）。毛孔直径从F0-R32时期逐渐减小，F0时期极显著高于R5和R32时期（P＜0.01），F15显著高于R5时期（P＜0.05），极显著高于R32时期（P＜0.01）。综上所述，确定F0、F15、R5、R32为毛囊生长变化关键节点。 试验二：基于皮肤毛囊转录组探究禁食诱导对蛋鸡毛囊生长发育的影响 1.转录组数据中共鉴定出17,108个已知基因，根据|log2FC|≥1，FDR＜0.05为筛选标准，共筛到2453个差异基因，其中1374个上调基因，1079个下调基因。 2.对F0-VS-R32、R15-VS-R32差异基因进行功能注释、趋势分析，发现其主要参与皮肤发育、表皮发育、上皮发育、皮肤水分调节、建立皮肤屏障、表皮细胞、角质形成细胞、上皮细胞分化等GO条目生物过程。 3.构建蛋白互作网络，筛选出与皮肤毛囊相关的差异基因DSP、FA2H、CERS3、FST、DHCR24、Krt75、SPTLC3、ELOVL7、ELOVL4和Krt6a，趋势分析前十关键基因为CDH1、PKP1、Pkp3、DSP、EPHA1、DSC1、CadN、TCF7、DSG2和TIAM1。 4.进一步挖掘候选基因，与表型结合进行权重基因集共表达分析，发现3个模块与甲状腺激素显著相关，得到darkturquoise module的3个hub gens:AMD5、Krt13和TGM5。甲状腺激素在羽毛和毛囊生长发育中可能扮演重要角色。 试验三：甲状腺素对鸡表皮毛囊干细胞和毛囊性状的影响 1.成功分离培养表皮毛囊干细胞，细胞贴壁生长，呈“铺路”状不规则细胞。整合素β1 （CD29）和整合素α6（CD49)免疫荧光染色为阳性。 2.表皮毛囊干细胞暴露在300 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸显著高于对照组、600 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸和1200 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸（P＜0.05）。 3.实时荧光定量显示甲状腺激素受体TRHA和TRHB在600 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸和1200 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸组的表达量显著高于对照组和300 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸组（P＜0.01）。?-catenin在600 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸组显著高于其他组（P＜0.05）。Notch1在300 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸组显著低于其他组（P＜0.01）。 4.鸡胚注射300 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸的背部皮肤直径显著低于其他处理组（P＜0.05），鸡胚注射600 ng/mL 四碘甲状腺原氨酸的背部皮肤密度显著低于其他处理组（P＜0.05）。 综上所述，本试验观察记录了禁食诱导生理重塑过程中羽毛和毛囊的具体变化，同时研究发现禁食诱导生理重塑可有效改善鸡的整体外观和冰鲜鸡的屠体外观，提高其经济价值。利用转录组测序分析发现甲状腺激素在皮肤毛囊生长发育过程中起关键作用，并在细胞和活体水平上进行验证，为蛋鸡诱导换羽生理重塑过程中羽毛和毛囊更好的重塑提供理论依据。
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