摘要
猴痘一直以来被视为非洲的一种罕见的人畜共患传染病，在中非和西非的部分国家会诊断出零星的猴痘病例。在过去 20年间，猴痘也曾数次小规模爆发于非洲以外区域国家。但 2022年多个国家相继报道了猴痘确诊病例，范围横跨美洲、欧洲、亚洲和非洲，在非洲流行区域以外出现了前所未有的全球传播。随着确诊病例持续上升，猴痘已经成为了全球较为关注的公共卫生问题。猴痘病毒（Mpox virus，MPXV）是引起猴痘的病原体，研究猴痘病毒与宿主相互作用的机制具有重要的意义和临床实用价值。目前针对猴痘病毒的研究主要集中在流行病学、临床检验检测、防治等方面，对于猴痘的预防和治疗药物主要来源于针对天花病毒药物，没有针对该病毒的特异性治疗药物。所以急需重视MPXV 与宿主的相互作用关系的研究，为猴痘的有效预防、研制抗病毒药物提供新的理论依据。 泛素化修饰可以调控多种病毒的复制，但与猴痘病毒的关系一直未被研究。我们参考了对猴痘病毒及痘苗病毒研究的已发表成果，选出了部分在猴痘病毒生命周期中具有重要作用的膜蛋白。为了探究猴痘病毒膜蛋白同泛素-蛋白酶体系统的关系，我们首先构建了部分病毒膜蛋白的真核表达质粒。在 HEK293T细胞中过表达这些质粒，同对照组相比较，使用蛋白酶体抑制剂MG132处理的细胞中病毒膜蛋白A18L的表达水平显著增加。同时，在HEK293T细胞中共转染病毒蛋白质粒和泛素沉默（Ub-KO）质粒后我们发现，同对照组相比，泛素分子沉默后病毒蛋白 A18L 表达水平明显增加。结合这两个实验，我们认为猴痘病毒膜蛋白 A18L 受泛素-蛋白酶体调控。我们的研究集中在病毒形态发生过程中发生作用的蛋白。A18L蛋白与痘苗病毒的 A17L蛋白高度同源，是病毒早期阶段形态变化过程所必需的蛋白，我们对 A18L 蛋白做了进一步的研究。通过免疫共沉淀结合质谱分析发现多种与 MPXV A18L 蛋白相互作用的因子DHX9、HSPA6、CDK1、DDB1、TRIM21、UBL4A、AMFR 以及蛋白酶体亚基等。在这些因子中只有 DDB1、TRIM21、UBL4A、AMFR 以及蛋白酶体亚基是在泛素过程中发挥作用的蛋白。通过 siDDB1、siTRIM21 介导的基因沉默以及过表达 UBL4A，我们发现在 siTRIM21介导的基因沉默细胞中 A18L蛋白的表达得到了明显的恢复，UBL4A对其没有影响。相反，在 siDDB1细胞中也没有看到A18L蛋白表达水平的恢复。 TRIM21蛋白是 TRIM家族中的一员，其作为 E3泛素连接酶在抗病毒天然免疫中发挥了重要作用。TRIM21 作为抗病毒因子与猴痘病毒的研究还未曾报道。本实验探究E3泛素连接酶TRIM21是否可以介导MPXV A18L蛋白泛素化使其降解。我们将TRIM21与A18L质粒在HEK293T细胞中共转染后，Western blot 实验表明 TRIM21 以剂量依赖的方式介导 A18L 蛋白的下调。我们通过CRISPR-Cas9技术构建了TRIM21基因敲除的HEK293T细胞系。在TRIM21基因敲除的细胞系中单独转染 A18L，结果表明 TRIM21敲除之后可以恢复 A18L蛋白的表达，进一步说明了 TRIM21 对 A18L 蛋白的作用。为了验证 TRIM21和A18L是否存在相互作用，我们通过在HEK293T细胞中共转染这两种质粒，免疫共沉淀实验表明 A18L 与 TRIM21 存在相互作用。同时，明确了 PRY 和SPRY是TRIM21与A18L相互作用的关键结构域，我们也验证了PRY和SPRY两个结构域缺失之后对 A18L泛素化的影响，结果表明，与野生型相比 PRY和SPRY缺失后介导的A18L泛素程度明显减弱。为了探究TRIM21介导A18L的泛素化类型以及泛素化关键位点，我们通过共转染降解实验和 IP实验，鉴定了TRIM21是通过K48泛素化类型介导A18L蛋白的下调，A18L蛋白的Lys166是TRIM21泛素化的关键位点。 综上所述，MPXV A18L 通过泛素-蛋白酶体途径降解，TRIM21 可以介导A18L蛋白 K48泛素化并促进其降解。本研究为研发针对 MPXV感染的特异性新药提供了潜在靶点。
NETL