摘要
肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是一种慢性进行性间质性肺疾病，以肺组织炎症细胞浸润、成纤维细胞增生和胶原沉积为主要病理特征。肺纤维化的发病机制目前尚未明确，由于其患病率的逐年上升及目前治疗措施的局限，针对发病机制的深入研究将为临床治疗奠定基础。研究显示，巨噬细胞向M2型极化在促纤维化过程中起重要作用，但目前关于调控巨噬细胞极化的分子机制尚未完全阐释清楚。既往研究显示，缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在肺纤维化发展过程中表达显著增加，转录活性增强，具有促纤维化的作用，但其是否参与调控巨噬细胞M2型极化进而促进肺纤维化尚不清楚，由此成为本研究拟解决的关键科学问题。本研究拟探索HIF-1α在巨噬细胞极化中发挥的作用及其对肺纤维化发生发展产生的影响。 目的：分析肺纤维化中巨噬细胞极化水平及HIF-1α的表达变化，探究HIF-1α是否参与M2型巨噬细胞极化，并进一步明确HIF-1α介导的M2型巨噬细胞极化对肺纤维化发生发展过程所产生的影响，为肺纤维化的临床治疗提供新思路。 方法：1.在体研究中，气管内注射博来霉素(Bleomycin,BLM)建立小鼠肺纤维化模型，利用HE染色、Masson染色观察肺组织病理学改变，ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)的表达水平，Western blot 法检测肺组织中 Smad2/3、磷酸化 Smad2/3(phosphorylated-Smad2/3,p-Smad2/3)、α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ 型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)的含量，检测肺组织和BALF中HIF-1α在细胞核和细胞质内的表达水平，免疫荧光染色法检测肺组织中巨噬细胞极化情况。2.体外研究中，构建小鼠肺上皮细胞系(Mouse lung epithelial cell line，MLE-12 cells)与小鼠骨髓源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages，BMDMs)体外共培养体系，通过转染HIF-1α-shRNA慢病毒质粒敲低BMDMs中HIF-1α的表达并利用白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)和白细胞介素-13(Interleukin-13,IL-13)诱导M2型极化，采用流式细胞术检测BMDMs的M2型极化水平，Western blot法检测 MLE-12 细胞内 Smad2/3、p-Smad2/3、波形蛋白(Vimentin，Vim)、α-SMA、FN的蛋白水平。 结果：1.BLM组与对照组比较，BLM组肺组织呈纤维化表现，BALF中TGF-β水平显著升高，肺组织中p-Smad2/3、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、FN蛋白含量明显升高，差异均有统计学意义(p＜0.01)。2.BLM组与对照组比较，肺组织内M2型巨噬细胞数量显著增多。3.BLM组与对照组比较，肺组织及BALF中HIF-1α在细胞核和细胞质内蛋白含量均显著升高，差异有统计学意义(p＜0.01)。4.HIF-1α-shRNA+M2组与NC-shRNA+M2组比较，BMDMs的M2型极化水平明显下降，差异有统计学意义(p＜0.01)。5.HIF-1α-shRNA+M2组与NC-shRNA+M2组比较，MLE-12细胞内p-Smand2/3蛋白含量显著下降，差异有统计学意义(p＜0.01)。6.HIF-1α-shRNA+M2 组与 NC-shRNA+M2 组比较，MLE-12 细胞内 Vim(p＜0.05)、α-SMA(p＜0.01)、FN(p＜0.01)蛋白表达显著下降，差异均有统计学意义，纤维化进程被抑制。 结论： 1.BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中巨噬细胞向M2型极化。 2.BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织及BALF中HIF-1α的表达水平在细胞核和细胞质中均显著升高。 3.敲低HIF-1α可抑制M2型巨噬细胞标志物的表达，说明在肺纤维化过程中,HIF-1α参与调控巨噬细胞向M2型极化。 4.敲低HIF-1α可抑制肺上皮细胞中TGF-β1/Smad2/3信号通路的促纤维化效应及肺纤维化相关蛋白的表达，说明HIF-1α介导的M2型巨噬细胞极化在肺纤维化过程中发挥重要作用。
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