摘要
目的： 卤代苯醌（Halobenzoquinones, HBQs）是近些年检测出的一类新型饮用水消毒副产物（DBPs），其毒性比生活饮用水卫生标准监管的DBPs更大，其中2,6-二氯-1,4-苯醌（2,6-dichloro-1,4-benzoquinone, DCBQ）在饮用水和泳池水中广泛检出，且其主要的代谢场所是肝脏。亚硝胺（Nitrosamines, NAs）是饮用水氯胺化后产生的 DBPs ，具有很强的肝毒性，其中二甲基亚硝胺（ N-nitroso dimethylamine，NDMA）检出率最高，目前已被国际癌症研究机构归类为2A类致癌物。人类通常暴露在多种DBPs的混合物中，然而，目前缺少HBQs和NAs共同暴露所产生联合毒作用的相关研究。本研究通过体内实验和体外实验，探讨HBQs 和 NAs 共同暴露对肝脏的联合毒作用及其作用机制，为进一步研究饮用水中DBPs共同暴露的毒作用奠定基础，为饮用水安全提供保障。 方法： 体外实验：将3种主要的HBQs，DCBQ、2,6-二溴-1,4-苯醌（2,6-dibromo-1,4-benzoquinone, DBBQ）、2,6-二碘-1,4-苯醌（2,6-diiodo-1,4-benzoquinone, DIBQ）和3种主要的NAs，NDMA、N-亚硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亚硝基二丙胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）组成9种二元组合，通过CCK-8法检测每种DBPs单一和联合暴露于L02人肝脏细胞24 h后的半数抑制浓度IC50值，利用联合指数法，计算联合指数CI50，通过CI50值评价各二元组合的联合作用。 体内实验：选择SPF级ICR鼠48只，雌雄各半，体重为18~22 g。将小鼠随机分为四组，包括溶剂对照组（医用芝麻油）、DCBQ（50 mg/kg）组、NDMA（3.6 mg/kg）组、DCBQ（25 mg/kg）+NDMA（1.8 mg/kg）组。每日固定时间灌胃给药，连续给药28天。每日观察小鼠状态，每3天记录一次体重。待染毒结束后处死小鼠，收集血清和脏器。称重后计算肝脏系数；HE染色观察肝脏病理变化；检测血清和肝脏中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽 S-转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的含量或活性；实时定量荧光PCR检测肝脏中核红细胞相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶（HO-1）、Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）、谷胱甘肽还原酶（GR）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶调节亚基（GCLC）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基（GCLM）的mRNA表达；ELISA法检测肝脏中细胞色素P450还原酶（CPR）、细胞色素P450 2E1（CYP 2E1）、NAD(P)H:醌氧化还原酶（NQO1）的活性；western blot法检测肝脏中氧化损伤相关蛋白的表达。 DCBQ 与 NDMA 反应产物鉴定：按照本研究的实验条件配置 DCBQ 和NDMA的混合体系，采用超高效液相色谱串联质谱法对反应产物进行鉴定。 结果： 1. HBQs 和 NAs 暴露引起 L02 细胞活力显著下降，呈明显的剂量-反应关系。3种不同HBQs对L02细胞的细胞毒性顺位为DBBQ≈DIBQ＞DCBQ；3种不同NAs对L02细胞的细胞毒性顺位为NDPA＞NDEA＞NDMA。 2. HBQs和NAs二元组合的联合指数CI50值均大于1，表明这9种组合对L02细胞的联合作用均为拮抗作用。 3. 各组小鼠体重差异无统计学意义，各组小鼠肝脏系数无统计学差异。 4. 与对照组相比，DCBQ组、NDMA组、联合组的ALT和AST水平显著升高（Plt;0.05），并且联合组的ALT和AST水平最高（Plt;0.05）。 5. DCBQ和NDMA对小鼠血清和肝脏中氧化损伤相关因子的影响： (1)与对照组相比，DCBQ组和联合组的血清和肝脏中的MDA含量均升高（Plt;0.05），DCBQ组和NDMA组血清中的GSH和SOD显著降低（Plt;0.05）， DCBQ组、NDMA组和联合组血清中的CAT均显著降低（Plt;0.05）。 (2)与对照组相比，DCBQ组、NDMA组和联合组肝脏中GSH和GSH-Px含量均显著降低（Plt;0.05）；NDMA组和联合组肝脏中SOD和CAT酶活均显著降低（Plt;0.05）NDMA组肝脏中GST酶活显著降低（Plt;0.05）。 6. DCBQ和NDMA对小鼠肝脏中的Nrf2信号通路的影响： (1)与对照组相比，NDMA组Nrf2蛋白表达显著下调（Plt;0.05），DCBQ组、NDMA 组及联合组 Nrf2 mRNA 表达显著降低（Plt;0.05）；DCBQ 组和联合组Keap1蛋白表达显著上调（Plt;0.05），NDMA组Keap1蛋白表达显著下调（Plt;0.05）；DCBQ组Keap1 mRNA表达水平显著升高，NDMA组和联合组Keap1 mRNA表达水平显著降低（Plt;0.05）；DCBQ组、NDMA组、联合组HO-1蛋白和mRNA表达均显著上调（Plt;0.05）。 (2)与对照组相比，NDMA组和联合组GR蛋白表达水平显著升高（Plt;0.05）， DCBQ组和联合组GR mRNA表达显著降低（Plt;0.05）。NDMA组和联合组GCLC mRNA和蛋白表达水平显著降低（Plt;0.05）；DCBQ组、NDMA组和联合组GCLM mRNA和蛋白表达水平显著降低（Plt;0.05）。 7. DCBQ和NDMA对小鼠肝脏中DBPs代谢酶的影响： (1)与对照组相比，DCBQ 组、NDMA组及联合组 CPR 蛋白表达水平显著下降，DCBQ组和联合组CPR酶活性显著升高（Plt;0.05）。 (2)与对照组相比，DCBQ组CYP 2E1蛋白表达水平显著升高，NDMA组和联合组蛋白表达水平显著降低；NDMA组CYP 2E1酶活性显著升高（Plt;0.05）。 (3)与对照组相比， NDMA 组和联合组 NQO1 蛋白表达水平显著下降（Plt;0.05）；NDMA组NQO1酶活性显著升高（Plt;0.05）。 8. DCBQ与NDMA反应产物的鉴定：在本实验条件下NDMA和DCBQ的每一个混合物的总离子色谱图中没有发现新的峰，没有形成反应产物。 结论： 1. HBQs和NAs暴露于L02细胞的联合毒作用均表现为拮抗作用。 2. DCBQ和NDMA暴露引起小鼠肝脏损伤，毒作用机制为诱导氧化损伤。 3. DCBQ和NDMA暴露激活小鼠肝脏Nrf2/Keap1信号通路，且共同暴露对该通路相关基因和蛋白的表达表现为拮抗作用。 4. NDMA 抑制 CYP 2E1、CPR 和 NQO1 这三种蛋白的表达，DCBQ 和NDMA共同暴露对3种蛋白表达的抑制呈现为拮抗作用。
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