摘要
目的: 本课题以萤火虫荧光素酶的Lovo-luc1细胞为基础，深入探析蟾灵膏联合卡培他滨(Chanling Gao+Capecitabine，CLG+CAP)对结直肠癌Lovo-luc1 细胞Balb/c裸鼠肝转移的作用机制。建立大鼠含药血清模型及原位Lovo-luc1结直肠癌肝转移(Colorectal cancer livermetastasis,CRLM)模型，以TGF-β/Smad介导EMT为切入点，探讨蟾灵膏联合卡培他滨(Chanling Gao+Capecitabine，CLG+CAP)对TGF-β/Smad及EMT相关因子钙粘附蛋白E(E-cadherin)、钙粘附蛋白N(N-cadherin)、锌指转录因子(Snail)、波形蛋白(Vimentin)表达情况，为CLG+CAP治疗CRLM提供客观、科学、有力的依据。 方法: 体外实验:雄性SD大鼠被随机分为:正常对照组(Control)、蟾灵膏组(Changling Gao,CLG)、卡培他滨组(Capecitabine，CAP)、蟾灵膏联合卡培他滨组(ChanlingGao+Capecitabine，CLG+CAP)。Control组给予生理盐水灌胃 Bid,CLG组给予2.1g/kg/d蟾灵膏水溶液灌胃Bid,CAP组大鼠给予0.422g/kg/d卡培他滨水溶液灌胃Bid,CLG+CAP组给予2.1g/kg+0.422g/kg联合用药水溶液胃Bid,连续灌胃7d后腹主动脉采集血液，离心、灭活、过滤后冻存备用。 体内实验:将对数生长期的Lovo-luc1细胞以2×107个/ml注入Balb/c裸鼠腋下，待肿瘤生长约1-1.5cm,剥离并均匀切成约2mm直径的肿瘤组织块备用，通过手术方式将瘤组织植入到Balb/c裸鼠盲肠末端肠壁，建立原位结直肠癌移植瘤模型。建模7d后，通过小动物活体成像仪IVIS?SPectrum将检测造模成功的Balb/c裸鼠随机分为模型组(Model)、蟾灵膏组(Changling Gao，CLG)、卡培他滨组(Capecitabine，CAP)、蟾灵膏联合卡培他滨组(Chanling Gao+Capecitabine，CLG+CAP)四组，另将剩下未造模的分为正常对照组(Control)。Control组、Model组每只裸鼠给予0.1ml生理盐水灌胃，Bid;CLG组每只裸鼠给予3.03g/kg/d蟾灵膏水溶液0.1ml灌胃，Bid;CAP组每只裸鼠给予0.359g/kg/d卡培他滨水溶液0.1ml灌胃，Bid;CLG+CAP组每只裸鼠给予3.03g/kg+0.359g/kg/d联合用药水溶液0.1ml灌胃，Bid。所有组均进行3个疗程的给药周期(共21d)。 结果: 体外实验:1.经CCK-8法结果示:与Control组相比，24h、48h、72h时，CLG组、CAP组和CLG+CAP组血清对Lovo-luc1细胞均有不同程度的抑制作用;24h、48h、72h时，CLG组、CAP组与CLG+CAP组相比，CLG+CAP组血清均对Lovo-luc1细胞抑制作用最为显著(P＜0.01)。集落形成实验显示:与Control组相比，CLG组、CAP组和CLG+CAP组血清均能不同程度抑制Lovo-luc1细胞集落形成。CLG组、CAP组与CLG+CAP组相比，CLG+CAP组Lovo-luc1细胞集落形成显著减少(P＜0.01)，CLG+CAP组相比于其他给药组可以抑制形成更多的集落。EdU检测结果示:与Control组相比，CLG组、CAP组和CLG+CAP组可见EdU细胞阳性不同程度减少;CLG组、CAP组与CLG+CAP组比较，CLG+CAP组EdU细胞阳性显著减少(P＜0.01)。结晶紫实验发现:与Control组相比，CLG组、CAP组和CLG+CAP组血清导致Lovo-luc1细胞出现不同程度的细胞皱缩，细胞数量逐渐减少，并有不同程度的固缩和空泡现象;含药血清干预24h时，CLG组、CAP组与CLG+CAP组比较，CLG+CAP组细胞数目明显减少;含药血清干预48h时，CLG组、CAP组与CLG+CAP组比较，CLG+CAP组细胞细胞较少，出现皱缩和空泡。以上结果证实CLG+CAP含药血清对Lovo-luc1细胞具有一定的抑制增殖作用。 2.CLG+CAP含药血清对人结直肠癌Lovo细胞迁移能力的影响:伤口愈合实验结果表明:与Control组相比，作用于24h、48h时，CLG组、CAP组和CLG+CAP组血清对Lovo-luc1细胞均出现不同程度迁移;干预24h后，CLG组、CAP组与CLG+CAP组相比，CLG+CAP组的Lovo-luc1细胞迁移率明显降低(P＜0.05);干预48h后，CLG+CAP组相对于CLG组、CAP组，CLG+CAP组的Lovo-luc1细胞划痕间隙未见明显变窄，迁移显著降低(P＜0.01)。证实了蟾灵膏联合卡培他滨含药血清呈时间依赖性抑制人直肠癌Lovo-luc1细胞的迁移。 体内实验:1.各组裸鼠给药前(0d)体重无差异性(P＞0.05);给药后，Control组裸鼠体重呈缓慢且平稳的趋势持续增长，Model组裸鼠体重呈直线下降的趋势，CAP组裸鼠于8d左右下降明显，可能与化疗药物毒副反应相关，CLG组裸鼠均缓慢下降。末次给药后(21d),各组裸鼠体重变化统计图发现:Control组裸鼠体重逐渐增长趋势;与Model组比较，CLG组体重明显升高(P＜0.05),CLG+CAP组裸鼠体重显著增高趋势(P＜0.01);CLG组、CAP组与CLG+CAP组相比，CLG+CAP组裸鼠体重明显高于CAP组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，但略高于CLG组裸鼠体重，差异无统计学意义(P＞0.05)。提示CLG+CAP可以改善裸鼠的体质量情况。与Model组、CLG组、CAP组比较，CLG+CAP组的裸鼠生存时间显著延长(P＜0.05)。表明，CLG+CAP能够提高结直肠癌裸鼠的生存时间，延长生存率。 2.末次给药后的移植瘤及转移瘤情况。①移植瘤:与Model组比较，CLG组、CAP组、CLG+CAP组裸鼠移植瘤重量、体积均明显缩小;CLG组、CAP组与CLG+CAP组相比，CLG+CAP组裸鼠移植瘤肿瘤重量显著减轻(P＜0.01),体积明显减小(P＜0.05)。②转移瘤:Ⅰ.肝脏重量:与Control组相比，Model组、CLG组、CAP组及CLG+CAP组裸鼠肝脏重量均不同程度降低;与Model组相比，CLG组、CAP组及CLG+CAP组裸鼠肝脏重量显著增加(P＜0.01),CLG组、CAP组与CLG+CAP组相比，CLG+CAP组裸鼠肝脏重量明显增加(P＜0.05)。提示CLG+CAP能改善肝重。Ⅱ.肝脏指数:与Model相比，CLG组、CAP组、CLG+CAP组裸鼠肝脏指数均不同程度升高;与Control组相比，CLG+CAP组裸鼠肝脏指数未见明显变化(P＞0.05),CAP组裸鼠肝脏指数上涨具有显著性(P＜0.05)。 3.移植瘤、肝脏转移瘤、结肠组织HE染色情况:①肝脏HE染色结果显示:Control组裸鼠肝组织形态正常、结构完整，质地光滑平整，肝细胞浆、胞质均匀饱满且呈放射状分布，边界清晰，肝索排列整齐，可见肝小叶及血窦结构，切片未见明显炎症浸润、瘀血及癌细胞侵占;Model组裸鼠肝脏形态及结构欠规则，质地粗糙，肝组织密集大量无规律的异形增生细胞，可见炎性细胞浸润，肝细胞排列分布杂乱，胞核溶解破坏增大，核质比例明显增大，肿瘤细胞压迫肝索排列紊乱;CLG组裸鼠肝脏形态完整，质地欠光滑，可见中等量的异性增生细胞，肝组织肝索排列错杂，胞核较深，可见慢性炎性细胞浸润;CAP组肝脏可见少量肿瘤细胞和慢性炎性细胞，肝索排列欠规则，可见髓外造血;CLG+CAP组肝组织中肝小叶结构尚存，肝索排列较规律呈放射状排列，可见个别慢性炎性细胞;肝窦和门区结构较完整，未见其他明显病理变化。 结论: 1.CLG+CAP含药血清对人结直肠癌Lovo-luc1细胞的增殖、迁移及侵袭具有抑制作用，促进细胞凋亡; 2.CLG+CAP含药血清上调E-cadherin蛋白的表达，下调N-cadherin、TGF-β1、P-Smad2的蛋白表达水平; 3.CLG+CAP可以改善CRLM模型鼠的体质量及肝脏重量; 4.CLG+CAP可以抑制原位移植瘤的增长，能减轻模型裸鼠的肿瘤负荷，提高生存率; 5.CLG+CAP可以抑制肝脏转移瘤的浸润情况，抑制结肠短缩，改善脾肿大; 6.CLG+CAP可以增强移植瘤组织中E-cadherin的含量，抑制TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、Smad4、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin的表达; 7.CLG+CAP可以抑制转移瘤组织中TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、Smad4、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin的蛋白表达，增加E-cadherin的含量; 综上所述，我们推测，蟾灵膏联合卡培他滨抑制结直肠癌移植瘤裸鼠体内肿瘤生长及肝脏转移可能是通过TGF-β/Smad调节EMT途径发挥作用，上调上皮细胞E-cadherin蛋白的表达，增强细胞-细胞间的黏附，抑制或延缓由上皮向间质细胞转变，抑制癌细胞的侵袭扩散，降低向远处转移的可能。
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