摘要
花型是观赏植物最重要的品质性状之一，花瓣形态是花型的组成要素。菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat.）作为重要的观赏植物和经济作物，以其千姿百态的花型著称于世，其舌状花形态又称为瓣型，是菊花花型形成的决定性因素之一。因此，解析菊花舌状花形态变异的遗传调控机制，对菊花瓣型的定向改良育种具有实际意义，也将为解析菊花复杂花型的形成机理奠定基础，具有重要的园艺学价值。然而由于菊花复杂的遗传背景和舌状花形态的多样性，导致舌状花形态变异调控机制的解析十分困难。毛华菊（C.vestitum）是与菊花近缘的六倍体野生种，其舌状花具有和菊花相同的平瓣、匙瓣和管瓣三种基本类型，是研究栽培菊花瓣型变异的理想模式材料。本研究以舌状花全平瓣和舌状花全管瓣两个在栽培中表型稳定的毛华菊株系为主要材料，以平、匙、管瓣着生于同一头状花序的混合瓣株系为辅助材料，在明确性状分离规律和形态差异形成关键时期的基础上，通过一系列分子生物学技术解析了毛华菊不同形态舌状花形成的原因，探究了调控舌状花形态差异的分子机制。获得的主要结果如下: （1）确定了毛华菊舌状花形态差异的性状分离规律。通过构建平瓣型株系（♀）×管瓣型株系（♂）和管瓣型株系（♀）×平瓣型株系（♂）两个F1代杂交群体，对杂交后代的头状花序类型和舌状花花冠筒基部合生程度值（corolla tube merged degree,CTMD）进行统计，发现两个群体后代的头状花序类型呈现丰富的变化，亲本的舌状花形态变异性状有效地遗传给了后代。杂交后代的舌状花CTMD出现了广泛的分离，且存在明显的偏态分布，偏向低值亲本，表现为负向优势，表明该性状可能存在显性遗传效应。 （2）利用石蜡切片和扫描电子显微镜观察将头状花序发育过程划分为10个阶段，其中Stage5-6为舌状花小花原基发育阶段，Stage7-8为舌状花花瓣原基起始阶段，Stage9-10为舌状花花冠生长发育阶段，也是舌状花形态差异出现的关键时期。平瓣型舌状花由于在背侧生长停滞，导致花瓣生长过程中在背侧呈现缺口，管瓣型舌状花的花瓣原基呈现完整的环状，背侧正常生长，最终舌状花生长形成管瓣。 （3）分别对平瓣株系和管瓣株系的头状花序进行了阶段特异性的比较转录组学分析，发现与Stage9-10阶段相关性最高的基因主要富集到植物激素信号转导通路中，不同瓣型样品间的差异基因主要为生长素相关基因。表达分析显示，生长素合成、转运及响应相关基因在全管瓣样本中表达水平普遍高于平瓣，其中CvARF5和CvARF6基因在全管瓣中高表达，而CvARF3基因则在全平瓣中高表达，而且与花瓣发育密切相关的B类和E类基因，包括CvPI、CvAP3、Cvdefh21、CvSEP3、CvCDM77,在全管瓣中的转录水平比全平瓣中更高。推测生长素在舌状花发育过程中发挥了关键作用，CvARFs可能作为关键基因，与花发育相关的同源异型基因协同作用，进而控制舌状花的形态差异。 (4)外源施加生长素(IAA)和生长素极性运输抑制剂(NPA)分别处理全平瓣株系和全管瓣株系，发现NPA能够使管瓣舌状花显著平瓣化。处理后的材料花部CvARF5表达量下降，而CvARF3上升。同时CvCDM77、Cvdefh21、CvIAA14、CvCYC2b、CvCYC2d、CvCYC2e、CvCYC2f、CvWRI1和CvNAP的表达水平相较于未处理的材料出现了显著变化。获得了以CvARF3和CvARF5为中心，众多转录因子参与其中的响应生长素变化进而调控舌状花形态差异的基因集群。 (5)系统进化和序列分析表明，CvARF3隶属于转录抑制因子分支，CvARF5隶属于转录激活因子分支。过表达CvARF3的管瓣型转基因株系的舌状花呈现平瓣化倾向，同时转基因株系花部中CvPI、Cvdefh21、CvSEP3和CvWRI1的表达水平显著低于野生的全管瓣株系，而CvARF6和CvIAA14的表达水平上升。过表达CvARF5的平瓣型转基因株系生长出管瓣型舌状花，转基因株系中CvPI、CvAP3、CvSEP3、CvCDM77、CvARF6和CvIAA14的表达水平较野生全平瓣株系有明显提高，而Cvdefh21和CvWRI1的表达显著下降。表明CvARF3和CvARF5在调控舌状花形态差异中发挥了关键作用，并影响着众多花发育相关同源异形基因的转录。 (6)基于酵母双杂交筛库和双分子荧光互补实验，发现CvARF5分别与CvARF6、CvIAA14、CvWRI1存在蛋白互作关系。通过启动子克隆和分析，发现CvPI、CvSEP3以及CvCDM77的启动子上存在CvARFs结合的AuxRE元件，利用酵母单杂交确定CvARF3和CvARF5均能够直接结合到CvPI和CvSEP3的启动子上。双荧光素酶实验表明，CvARF3能够抑制CvPI和CvSEP3的转录活性，而CvARF5则能够显著激活CvPI和CvSEP3的转录。CvARF3和CvARF5同时作用时，CvARF5的激活效应显著降低，推测二者可能竞争结合下游基因识别位点，且CvARF3的结合能力更强。此外，CvARF5与CvARF6形成蛋白二聚体时，其对靶基因的激活作用显著提高。 综合以上结果，本研究解析了生长素调控毛华菊舌状花形态差异的分子机制:平瓣型舌状花中CvARF3的表达水平较高，其响应生长素信号抑制下游CvPI和CvSEP3的转录，致使舌状花在发育初期无法在背侧形成花瓣原基而出现缺刻，最终发育形成平瓣型舌状花;管瓣型舌状花中CvARF5的转录水平更高，其响应生长素信号激活下游CvPI和CvSEP3的转录，促进舌状花花瓣原基形成完整的环状，进而发育成管瓣型舌状花。同时CvARF3维持的平瓣舌状花发育模式十分稳定，而CvARF5维持的管瓣舌状花发育模式容易在生长素分布失衡的情况下被破坏。本研究解析了毛华菊舌状花形态差异的转录调控机制，对利用生长素相关基因调控舌状花形态进而开展菊花花型定向改良育种具有实际意义，也可为其他花卉瓣型研究和花型改良的分子育种提供参考，对揭示生长素调控高等植物花瓣形态发育的机制也具有理论价值。
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