细胞分裂素氧化脱氢酶基因MtCKX1在蒺藜苜蓿下胚轴、叶片及根系形态发生中的功能研究

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中文摘要：蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是一种重要的豆科模式植物。细胞分裂素作为一种主要调节植物形态发育进程的重要植物激素，研究其代谢途径在生长发育中的功能和调节机制不仅可以完善细胞分裂素在形态发育中的分子调控机理，也能为豆科牧草的种质改良提供理论依据和物料储备。目前，关于细胞分裂素对形态发育调节的相关研究，主要集中在生理指征、生物合成和信号转导等方向。其降解代谢途径在形态发育中的分子机制尚不明确。细胞分裂素氧化脱氢酶(CKX)是唯一已知不可逆降解细胞分裂素的酶，本研究中选择该酶的合成基因MtCKX1作为研究对象，通过多种分子生物学手段挖掘其在植物形态发育中的功能和调控机理。主要研究结果如下: 1、通过启动子克隆、顺式作用元件分析和激素诱导表达分析表明，MtCKX1基因启动子包含多个激素响应元件，同时，MtCKX1基因表达水平受IAA、6-BA、ABA、MeJA、GA的诱导。通过构建启动子截短序列的转基因拟南芥株系并对其进行GUS染色分析表明CKX1起始子上游1789-1125bp区间内存在激活后续GUS表达的区段。另外，还通过DNA-Pull down筛选了该基因上游调控的候选转录因子，但并未筛选到功能相关的成员。 2、通过基因克隆和生物信息学分析表明，该基因含有1条长1635bp的完整编码区，编码1条含544个氨基酸的多肽链。通过组织特异性表达分析表明，该基因在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花中均呈现较高的表达水平，但差异不显著。而果荚和种子中的表达量显著低于其他组织，其中果荚中的表达量最低。通过亚细胞定位表明，MtCKX1基因编码的蛋白定位于细胞核内。通过转基因拟南芥和生理指标测定表明，过表达MtCKX1基因能够降低转基因拟南芥中细胞分裂素含量。 3、通过构建蒺藜苜蓿过表达株系并对其进行表达分析证明，过表达MtCKX1基因会导致转基因苜蓿下胚轴的伸长，且下胚轴形态发育相关基因GH3.1与CKX1基因的表达水平呈负相关;也会导致转基因苜蓿根系发达，且根系形态发育相关基因PIN1、ARR1与CKX1基因的表达水平呈正相关。通过构建CRISPR/Cas9敲除株系，结合石蜡切片、扫描电镜和表达分析，我们观察到敲除株系在生长发育的过程中，叶片形态产生了较大的差异。在野生型蒺藜苜蓿中，主叶呈三角形至长圆形、复叶呈三角形，叶面积适中;在过表达株系中，主叶呈长圆形至菱形，复叶呈圆形至长圆形，叶面积较大;在敲除株系中，主叶和复叶均呈心形至三角形，叶面积较小。且叶片形态发育相关基因CYCD3、GRF5和SAP与CKX1基因的表达水平呈正相关。叶片木质部的细胞数量和面积呈现出敲除＜WT＜过表达的趋势，同时孔下室尺寸也会受到影响。另外，MtCKX1基因表达量的高低影响了叶片表皮毛突起的排列特征和气孔的开合程度和比例，且气孔形态发育相关基因ARR17与CKX1基因的表达水平呈负相关。 4、通过酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀等方法，证明MtCKX1蛋白与14-3-3和AQP1蛋白直接互作，通过表达分析发现MtCKK1调节二者的表达水平。 5、通过转录组分析发现，过表达组共筛选到3667个DEGs,其中1536个上调，2131个下调。敲除组筛选出3172个DEGs,其中1472个上调，1700个下调。通过GO数据库的富集发现，高水平的MtCKX1所诱导的差异表达基因高度富集的功能包括生长素响应和脱落酸结合。通过KEGG数据库的富集发现，MtCKX1基因涉及最集中的调控通路除了植物激素信号转导，还有MAPK信号、淀粉和蔗糖代谢、昼夜节律和光合作用。 6、通过代谢组分析发现，一共注释到1975个代谢物。在过表达组中差异代谢物83个，其中上调34个、下调49个;敲除组中差异代谢物199个，上调89个、下调110个。通过差异代谢物火山图发现，代谢物1-氨基环丙烷-1-羧酸酯(ACC)受到CKX1显著的负调控。在KEGG注释与富集分析中，我们富集到了 α-亚麻酸代谢、苯甲酸盐降解和多环芳烃降解等代谢通路。这些结果表明，MtCKX1基因在下胚轴、根系、叶片、气孔等多个植物形态发育进程中发挥着重要作用，为日后的种质改良提供分子理论依据和材料支持。

作者：

李殷睿智

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关键词：

蒺藜苜蓿形态发育细胞分裂素降解机理细胞分裂素氧化脱氢酶

授予学位：

博士

学科专业：

草学

导师：

韩烈保

学位年度：

2022

学位授予单位：

北京林业大学

语种：

中文

中图分类号：