摘要
背景: 结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是人类癌症相关死亡的最常见原因之一。作为消化道层出叠见的恶性肿瘤类型，全球发病率排名第三。近年来，随着经济水平提高和生活方式改变，CRC在我国的发病率、死亡率逐年上升。流行病学调查显示，CRC的发生、发展是多因素、多阶段综合作用的复杂结果，肿瘤细胞通过肿瘤微环境、能量代谢和基因转录等获得了多种独具特性的生物学能力，其中之一就是糖代谢的重编程。早在一个世纪前，德国科学家Otto Heinrich Warburg就提出肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下也倾向于通过糖酵解来获得能量，即“Warburg Effect”学说。随着肿瘤代谢研究的深入，糖代谢重编程为肿瘤细胞存活、增殖和转移提供了所必需的能量和生物大分子，被认为是调节肿瘤疾病进程的关键因素。因此，从糖代谢的角度来切入研究抗肿瘤药品，已经成为目前CRC有望治愈的新希望。 目前大量研究证实中医药在协同CRC化疗、免疫和靶向治疗上具有增效减毒、降低复发转移率的独特优势，中西医结合综合治疗已成为治疗CRC的新模式，为CRC提供了更多治疗途径和思路。 国医大师刘尚义教授在长年累月的临床工作中，提炼出了具有中医基础指导，融汇科学性和实用性的“从膜论治、引疡入瘤”学术思想，结合中药组方优势形成了集养阴散结、清热解毒、活血消癥为一体的蟾灵膏（Chanling Gao，CLG）。此膏不管是在基础研究还是临床实践中均能证实可以实现“人癌共生”的宗旨。本研究团队在临床运用刘老的CLG治疗CRC患者过程中，实践观察认为对于CRC患者更具有针对性和适用性，在很大程度上改善了CRC病患的生活质量。 目的: 本研究以标记萤火虫荧光素的人结直肠癌HCT 116-luc1细胞为基础，通过体内、外实验深入探析CLG联合卡培他滨(CLG+Capecitabine，CLG+CAP）对人结直肠癌HCT 116-luc1细胞Balb/c裸鼠的作用机制。建立大鼠含药血清模型及原位人结直肠癌HCT 116-luc1细胞CRC模型，以糖代谢为切入点，探讨CLG+CAP对CRC的作用机制，及其对糖代谢标志物表达的影响;从糖代谢视角，基于AMPKα1信号通路的调控作用探讨CLG+CAP可能的作用机制。从而进一步夯实中医药防止CRC疾病的相关理论，发挥中医药抗肿瘤的优势。 方法: 1.细胞实验: 将SPF级SD雄性大鼠随机分为:空白对照组(Control)，CLG组、CAP组CLG+CAP组。Control组大鼠给予生理盐水灌胃，Bid,CLG组按照临床等效剂量20g/d给予蟾灵膏水溶液灌胃，Bid,CAP组大鼠给予0.359g/kg/d卡培他滨片水溶液灌胃，Bid,CLG+CAP组按4.2g/kg/d+0.359g/kg/d先后间隔30min分别给予CLG、CAP水溶液灌胃，Bid。连续灌胃7d后腹主动脉取血，离心、灭活、过滤除菌后于-80℃保存备用。将所得含药血清分别处理人结直肠癌HCT116-luc1细胞系不同时间(12h、24h、48h、72h)进行如下检测: 选取人结直肠癌HCT 116-luc1细胞，并将其随机分为四组。即①Control组:细胞接种于含正常大鼠血清的DMEM培养基中培养;②CLG组:使用包含20％蟾灵膏含药血清的DMEM培养基中培养;③CAP组:使用包含15％卡培他滨含药血清的DMEM培养基中培养;④CLG+CAP组:使用包含10％CLG+CAP含药血清的DMEM培养基中培养。采用CCK-8法检测不同分组含药血清对人结直肠癌HCT 116-luc1细胞活力的影响;细胞划痕实验检测不同分组含药血清对人结直肠癌HCT 116-luc1细胞干预24h、48h时的愈合情况;Transwell实验观察不同分组含药血清对人结直肠癌HCT 116-luc1细胞干预24h、48h的侵袭情况;测定4个不同分组含药血清干预人结直肠癌HCT 116细胞48h后的葡萄糖(Glu)含量、乳酸(LD)水平、乳酸脱氢酶(LDH)含量，12h、24h时细胞内、外pH值的影响，72h时各不同分组中ATP的浓度;以AnnexinⅤ—FITC/PI双标记法流式细胞术检测人结直肠癌HCT 116细胞的凋亡率;通过电子显微镜(EM)断层扫描线粒体内部结构，观察线粒体形态结构变化，证明线粒体生物能量学在肿瘤细胞糖代谢过程中的重要性。 2.动物实验: 选取对数生长期的人结直肠癌HCT 116-luc1细胞构建荷瘤鼠Balb/c裸鼠模型，待肿瘤生长至平台期时(瘤体约1□ 1.5cm大小)，剥离肿瘤组织，并将其均匀切成直径约0.2cm大小的肿瘤组织块置于预冷生理盐水中备用，采用外科手术法将瘤块异种移植到Balb/c裸鼠盲肠游离末端的肠壁上，构建原位结直肠癌移植瘤模型。造模第7d时，通过小动物活体成像IVIS?Spectrum系统检测后将造模成功的Balb/c裸鼠随机分为模型组(Model group)、CLG组、CAP组、CLG+CAP组，继续将正常的未进行任何手术及治疗的Balb/c裸鼠分组为Control组。Control组、Model组每只裸鼠给予0.1ml生理盐水灌胃，Bid;CLG组每只裸鼠予以3.03g/kg/d CLG水溶液0.1ml灌胃，Bid;CAP组每只裸鼠给予0.359g/kg/d CAP水溶液0.1ml灌胃，Bid;CLG+CAP组每只裸鼠按CLG 3.03g/kg/d+CAP 0.359g/kg/d先后分别间隔30min给予CLG、CAP水溶液灌胃;各组给药周期均为3个疗程(共计21d)。进行如下实验步骤: 在给药期间，每天观察Balb/c裸鼠的一般状况，每3天对其进行称重并记录;在造模成功后第7d、14d、21d、28d时的四个时间点采用小动物活体成像IVIS?Spectrum系统检测裸鼠腹部移植瘤的生长变化情况;药物干预21天后，眼球取血，脱颈法处死裸鼠并剥离移植瘤及结直肠，拍照、称重并记录数据，计算抑瘤率;后进行结直肠瘤瘤体、癌旁组织及肝脏的HE染色;利用Western blot检测结直肠原位移植瘤瘤体AMPKα1、p-AMPKα1、HIF-1α、HK2、Glut1、LDHA、c-Myc、p53蛋白表达情况。 结果: 1.细胞实验: 在细胞实验中发现，不同分组含药血清在不同时间干预人结直肠癌HCT 116-luc1细胞后证实CLG+CAP组能更好地抑制其生物学行为。CCK-8法检测结果显示，与Control组相比，24h、48h、72h时，CLG组、CAP组、CLG+CAP组对人结直肠癌HCT 116-luc1细胞活力不同程度受到抑制;CLG+CAP组比较于CLG组、CAP组对人结直肠癌HCT 116-luc1细胞活力的抑制显著，且抑制作用呈浓度-时间依赖性(P＜0.01)。划痕实验结果表明，分别在24h、48h时间段，与Control组相比，CLG组、CAP组、CLG+CAP组对人结直肠癌HCT 116-luc1细胞的迁移具有不同程度的抑制作用;干预24h时，CLG+CAP组与CLG组、CAP组相比，CLG+CAP组人结直肠癌HCT 116-luc1细胞的迁移明显缩小(P＜0.05);干预48h时，CLG+CAP组比较于CLG组、CAP组，对人结直肠癌HCT 116-luc1细胞迁移抑制显著增强(P＜0.01)。Transwell侵袭结果提示，与Control组相比，CLG组、CAP组、CLG+CAP组人结直肠癌HCT 116-luc1细胞侵袭量不同程度减少;干预24h时，CLG组、CAP组、CLG+CAP组比较Control组，细胞侵袭量明显减少(P＜0.01);干预48h时，CLG+CAP组与CLG组、CAP组相比，侵袭细胞较少(P＜0.05)。CLG+CAP组干预的人结直肠癌HCT 116-luc1细胞在集落形成实验中几乎无法形成集落征象，以上结果表明，CLG+CAP组含药血清抑制了人结直肠癌HCT 116-luc1细胞的增殖，降低了人结直肠癌HCT 116-luc1细胞的自我更新能力(P＜0.01)。 2.动物实验: 从原位结直肠癌裸鼠的体内实验中可知，CLG+CAP组裸鼠体重总体情况、一般状况均优于Control组、CLG组、CAP组(P＜0.01);CLG+CAP组对原位结直肠癌裸鼠结直肠的长度改变、瘤体体积的抑制情况均较Control组、CLG组、CAP组单纯用药具有相对明显优势(P＜0.05)。 结论: 1.蟾灵膏联合卡培他滨协同给药可以延缓糖代谢进程，能够抑制人结直肠癌HCT 116-luc1细胞的存活能力和迁移、侵袭的恶性生物学行为。 2.蟾灵膏联合卡培他滨协同给药能够抑制结直肠癌原位移植瘤裸鼠体内瘤体生长，具有改善结直肠短缩情况、降低转移风险的作用。 3.蟾灵膏联合卡培他滨协同给药通过改善肿瘤微环境，从糖代谢途径减少人结直肠癌HCT 116细胞的能量来源，抑制糖代谢相关蛋白AMPKα1、p-AMPKα1、HIF-1α、HK2、Glut1、c-Myc、LDHA的表达水平。 综上，我们推测，蟾灵膏联合卡培他滨协同给药对结直肠癌原位移植瘤裸鼠体内瘤体生长的抑制作用可能是通过激活AMPK信号通路，改善肿瘤微环境，调节人结直肠癌HCT 116细胞复杂、动态的生物学糖代谢过程，诱导其发生凋亡而实现的。
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