摘要
目的:基于HIS/PAR-2途径观察加味过敏煎对DNFB诱导的AD小鼠模型肥大细胞脱颗粒信号自身放大的调节作用，探讨加味过敏煎缓解瘙痒途径作用机制。 方法: 1.选取50只BALB/c小鼠随机设置正常组、模型组、过敏煎组、加味过敏煎组和富马酸酮替芬片组，每组10只。正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃，过敏煎组按生药10.27 g/(kg·d)灌胃，加味过敏煎组按生药14.39 g/(kg·d)灌胃，富马酸酮替芬片组用生理盐水将其稀释为0.33 mg/(kg·d)灌胃。通过DNFB建立AD模型小鼠，在第21天灌胃给药后2小时麻醉处死小鼠并进行颈背部皮肤取材。通过观察小鼠皮肤形态学变化、搔抓次数的改变;HE染色观察皮肤组织病理形态学改变及炎性细胞浸润情况;甲苯胺蓝染色考察皮肤中MC脱颗粒的表达情况并计算其抑制率，所有计量资料以GraphPad Prism 9.0.0软件进行数据统计处理。 2.采用UPLC-QE-MS分析过敏煎和加味过敏煎中的化合物差异，探讨加味过敏煎中可能发挥止痒、抗炎和抑制肥大细胞脱颗粒作用的物质基础成分。 3.造模部分同1，通过ELISA检测皮肤中HIS和MCT的蛋白表达水平;使用WB和免疫荧光技术分析皮损中MCT、PAR-2、H1R、H2R和H4R蛋白的表达水平变化;采用RT-PCR检测皮损中PAR-2、H1R、H2R和H4RmRNA表达水平并分析表达程度。 结果:1.DNFB刺激小鼠后模型组皮损出现红斑、皮肤皲裂伴有出血、部分坏死有结痂，模型组与其余组相比搔抓次数明显增多(P＜0.01)，病理结果显示模型组皮损表皮结构基本消失，真皮层结构模糊，坏死区伴有大量炎性细胞浸润，可见组织水肿，MC脱颗粒数表达上升及脱颗粒抑制率最低;与模型组比较，富马酸酮替芬片组治疗后AD小鼠皮损程度减轻，改善了皮肤病理现象，以红斑和干燥痂皮为主，搔抓次数减少，肥大细胞脱颗粒数量下降;加味过敏煎组干预治疗后比过敏煎组显著改善AD的病理表现，皮损情况好转，坏死程度减轻，痂皮较少，且搔抓次数降低，但搔抓次数与过敏煎组比较差异无统计学意义(P＞0.05);加味过敏煎组和其余治疗组相比病理切片观察无或轻微炎性细胞浸润，有部分新生毛细血管形成，MC脱颗粒抑制率上升最明显，和过敏煎组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），其脱颗粒抑制率为70.04％。 2.通过UPLC-QE-MS筛选与鉴定结果显示，过敏煎和加味过敏煎符合差异标准的化合物共有109个，其中正离子有77个，负离子有32个，推测加味过敏煎发挥止痒、抗炎、抗过敏，缓解肥大细胞脱颗粒机制可能与含量相对上调的化合物有关，如生物碱，苯丙素类、芳香化合物、萜类、酰胺类、黄酮类及酚类物质，其中FC值较突出的甲基丁香酚、白鲜碱和芥子碱的抗炎、抗过敏、抑制MC脱颗粒作用尤为显著。 3.ELISA结果显示，模型组与其余组比较，模型组皮损中HIS和MCT蛋白表达水平增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），加味过敏煎组与过敏煎组比较，加味过敏煎组HIS和MCT表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）;通过免疫荧光和WB显示模型组较其余组皮损中PAR-2、MCT、H1R和H4R蛋白表达含量明显升高，H2R蛋白水平表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）;加味过敏煎组与过敏煎组比较，加味过敏煎组PAR-2、MCT、H1R和H4R蛋白表达含量降低，H2R蛋白水平表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）;其余组与模型组比较，模型组小鼠皮损中PAR-2、H1R、H2R和H4R mRNA表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）;过敏煎组与加味过敏煎组比较，加味过敏煎组能下调小鼠皮损中PAR-2,H1R,H2R和H4R mRNA表达水平，其中PAR-2、H1R和H4R mRNA差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），与H2R mRNA表达有差异，但无统计学意义（P＞0.05）;富马酸酮替芬片组与模型组比较，HIS、MCT、PAR-2、H1R和H4R蛋白表达下降（P＜0.05或P＜0.01）,H2R蛋白水平表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）;下调小鼠皮损中PAR-2,H1R,H2R和H4R mRNA表达水平，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。 结论:加味过敏煎与过敏煎比较，可能通过甲基丁香酚、白鲜碱和芥子碱等物质达到缓解瘙痒作用，其机制可能与抑制AD模型小鼠HIS/PAR-2途径，进一步调控肥大细胞脱颗粒信号自身放大有关。
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