摘要
兰科植物由于特殊的进化地位和物种的多样性，在对各种生境的适应中形成了更加精致多样的花器官，其绚烂多姿的花形态展现出迷人的魅力和广泛的研究价值，是研究花器官发育模式的良好材料。在兰花中，“花被代码”（“P-code”）假说认为B类MADS-box基因的不同组合导致了兰科中唇瓣和花瓣的分化，但对于非MADS-box基因在兰科花发育中的作用却知之甚少。在本研究中，我们通过RNA-Seq 进行了三唇瓣小兰屿蝴蝶兰（P. equestris var.trilip）的唇状花瓣（Lip-like petal）和唇瓣（Lip）以及单唇瓣小兰屿蝴蝶兰（P. equestris）的花瓣（petal）和唇瓣（Lip）的差异表达基因分析，筛选出一个调控唇瓣发育的重要基因PeKAN2。蛋白三维结构预测分析和亚细胞定位表明PeKAN2是一个具有MYB类结构域和GARP结构域的GARP家族的核定位转录因子。通过对PeKAN2在三唇瓣小兰屿蝴蝶兰的根、茎、叶、花芽和花等器官中的表达量检测，发现花中的表达显著高于其它器官，花芽的RNA原位杂交显示PeKAN2的mRNA主要分布在唇瓣和合蕊柱上。VIGS沉默PeKAN2的表型和冷冻扫描电镜的观察表明，PeKAN2介导三唇瓣小兰屿蝴蝶兰中的唇状花瓣（Petal-Like）向唇瓣（Lip）的转化，可能在促进唇瓣的形成中发挥重要作用。实时荧光定量分析结果显示，PeKAN2在唇瓣发育和维持过程中（S1-S6）保持高水平表达，但在三唇瓣小兰屿蝴蝶兰（S7-S8）唇瓣结构基本形成后下降，与已报道的唇瓣发育相关基因PeMADS3、PeMADS4、PeMADS9 的表达模式高度相似。经过酵母双杂交、双分子荧光互补技术以及免疫共沉淀技术，证明了PeKAN2蛋白和PeMADS3、PeMADS4、PeMADS9蛋白存在相互作用。利用DAP-seq技术，挖掘出两个控制花瓣发育的MADS-box基因，分别是PeAGL9和PeMADS2。通过酵母单杂技术和荧光素酶报告基因系统，证明了PeKAN2蛋白可以结合到PeAGL9和PeMADS2的启动子上，作为转录抑制子负调控 PeAGL9 和 PeMADS2 的表达。本论文我们揭示了非 MADS-box 基因PeKAN2在蝴蝶兰唇瓣发育中的积极作用，丰富了非MADS-box基因在兰科花器官发育上的贡献。
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