摘要
鸽Ⅰ型副粘病毒（Pigeon paramyxovirus type Ⅰ，PPMV-1），又称鸽新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV），是副粘病毒科、副粘病毒属、禽副粘病毒Ⅰ型 （Avian paramyxovirus type Ⅰ，APMV-1）的唯一成员。可引起鸽急性、高度接触性、败血性传染病。不同年龄、品种的鸽都易感，发病率可达到100%，死亡率可高达80%，是危害养鸽业重要疫病之一。因此，开展PPMV-1的研究工作，研发诊断与疫苗防控技术十分必要。本研究利用SPF鸡胚接种，分离到1株PPMV-1,经RT-PCR和HA等验证了分离株的生物学特性，研究了分离株对肉鸽的致病性及免疫原性，证实分离株能引起肉鸽发病，同时能诱导产生免疫抗体，为PPMV-1疫苗研发奠定基础。 1.PPMV-1的分离鉴定、全基因组测序及遗传进化分析 本研究利用SPF鸡胚分离到一株PPMV-1，命名为Pi/SHJS/2023-1，该分离株基因组全长为 15192 bp（Genbank 登陆号为 PP444693），包括 6 个结构基因（NP-P-M-F-HN-L）。遗传进化分析表明，Pi/SHJS/2023-1属于ClassⅡ类基因Ⅵ型毒株，与国内Pigeon/China/BJ2018株同源性最高，核苷酸相似性达到97.8%，氨基酸相似性为94.8%，与中国PPMV-1分离株聚集在同一组。其F蛋白裂解位点氨基酸序列为 112R-R-Q-K-R-F 117，符合强毒株特征。 2.PPMV-1荧光定量PCR检测方法的建立 建立了一种 PPMV-1 的 SYBR Green Ⅰ荧光定量 PCR 检测方法，敏感性、重复性试验检测，检测最低限量为4.38×10-1 拷贝/μL，具有较好的敏感性；批内和批间重复试验的变异系数均小于1%，具有较好的重复性；采用建立的荧光定量PCR方法检测89份临床样本，结果显示，实时荧光定量PCR方法阳性检出率高于普通PCR，检测方法更为灵敏。 3.Pi/SHJS/2023-1分离株对乳鸽的致病性研究 30 日龄乳鸽分为 4 组，分别腿部肌肉注射接种不同剂量的 Pi/SHJS/2023-1病毒：高剂量接种组（A 组）10-3×10-8.44/0.1 mL）、中剂量接种组（B 组） 10-4×10-8.44/0.1 mL、，低剂量接种组（C 组）10-5×10-8.44/0.1 mL，对照组鸽子每只腿部肌肉注射无菌 PBS 0.2 mL。每天观察鸽子临床症状，检测排毒情况。死亡鸽子进行剖检及组织病理学观察，并进行组织脏器的病毒载量检测。 结果，肌肉注射攻毒后2 d高剂量组乳鸽即出现临床症状，拉灰绿色稀水样粪便、双翅下垂、羽毛松散、食欲不振、不断震颤、瘫痪等，攻毒后第6 d开始出现死亡，实验组总计发病率达 100%，排毒率达 100%，死亡率达 60%；剖检可见感染鸽脑部充血，有出血点，肌胃、腺胃存在明显出血点，肺出血，出现黑色斑点（块）；病理表现为肺脏血管外围有炎性细胞浸润，肺房壁上皮细胞变性坏死；小肠黏膜下出血明显，小肠绒毛坏死，大量小肠绒毛断裂、脱落；组织病毒载量检测显示，病毒在脑、气管和肺中含量相对较高，在肺中的病毒量最高。 4.Pi/SHJS/2023-1分离株的免疫原性研究 为了探究Pi/SHJS/2023分离株的免疫原性，大量增殖Pi/SHJS/2023-1病毒并测定EID50，用甲醛灭活后制备油佐剂灭活疫苗，免疫30日龄乳鸽，测定免疫抗体消长情况。乳鸽30日龄一免，45日龄二免，二免后35 d用低代次强毒攻击，检测排毒情况。并根据临床症状，每组处死1只鸽子进行剖检，观察组织病理学变化，测定组织病毒载量。结果，免疫后第6周血清中抗体水平还处于上升阶段，不同剂量免疫肉鸽后，均产生较好的免疫抗体水平，免疫后 11 周血清抗体 HI效价≧5 log2。 低剂量免疫组攻毒后第3-14 d可检测到排毒，高、中剂量免疫第4-12 d排毒。对照组攻毒后后第2-14 d持续排毒，表现出发病快，排毒早，病程长的特点，证实PPMV-1灭活疫苗能显著抑制病毒增殖，降低排毒量。 剖检发现对照组表现更严重病症，脑部严重充血并有大量出血点；肌胃和腺胃存在明显出血点，肺出血；低剂量免疫组鸽脑部充血和出血，肌胃和腺胃存在少量出血点，肺出血；中、高剂量免疫组鸽子脑部轻微充血，肌胃和腺胃无明显症状。组织病理学观察，对照组和低剂量组小肠绒毛出血坏死，腺胃粘膜和肌层浆液性水肿，肺泡间隔断裂，炎性细胞浸润。高剂量免疫组小肠绒毛萎缩，黏膜下层有轻微出血，腺胃黏膜下层浸润有少量淋巴细胞，肺脏静脉充血，部分血管外围被淋巴细胞浸润。 组织病毒载量检测结果显示，鸽脑、气管、肺、肠道组织中病毒含量较高，肝脏和脾脏中病毒含量较低，肾只在未免疫的对照组中检测到极微量的病毒核酸，且各免疫组中组织的病毒含量是低于未免疫组。证实该PPMV-1灭活疫苗具有良好的免疫效果，免疫后产生的抗体能有效对抗侵入的病毒。
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