摘要
漆酶（Laccase）是一种蓝色含铜多酚氧化酶，通常含有4个铜离子，最早在漆树中发现，分布范围广，涉及动植物、地衣、真菌和细菌等。漆酶能够催化氧化多种酚类和非酚类底物，在生物检测、食品工业和废水处理等方面都有着广泛的应用价值。因其副产物只有水，也被称为绿色生物催化剂。漆酶 Melac 13220作为一种新型细菌漆酶，只含有一个铜离子且颜色为白色，能在没有介体的情况下氧化非酚类底物，其性质和作用机理尚未明确研究，具有一定的研究价值和开发潜力。 现有细菌漆酶Melac 13220的比活力不高，因此选择对其进行分子改造以期获得比活力更高的突变体并加以应用。本论文通过序列比对、同源建模、分子对接和分子动力学计算等生物信息学和计算生物学手段，选择特定氨基酸位点对Melac 13220进行定点突变，探究突变体酶学性质，最后将其用于多种染料的降解。具体研究内容和结果如下： 1.本论文对实验室已有的Methylobacterium extorquens非蓝漆酶Melac 13220进行同源建模，通过与高酶活的嗜热漆酶进行序列比对，结合序列比对结果、分子对接结果和相关软件筛选出11个氨基酸位点进行定点突变，成功构建并表达了12个单点突变体。 2.从 12个单点突变体中初步筛选出 6 个有益突变，对突变体进行酶学性质表征。并继续构建了3个叠加突变体。大部分突变体最适温度升高，其中酶活提高较明显的突变体S157A，A239L和G397Q，它们在80℃下的活力分别是野生型的2.33、1.92和2.76倍。在60℃下，叠加突变体A239L/G397的酶活是野生型的2.94倍。 3.将野生漆酶Melac 13220和突变体作用于四种常见工业染料，在不加介体HBT 的情况下，突变体对染料的降解能力增强。野生型对结晶紫的降解能力较差，8 h的脱色率只有9 %，S157A，G397Q和三个叠加突变体对结晶紫的脱色效果较好，表现最好的G397Q 8 h 脱色率能够达到30%。突变体S157A/G397Qamp;nbsp;对靛蓝的脱色效率提高到由27 %提高到33 %。突变体S157A和G397Q对刚果红的降解能力分别提高了1.38和1.08倍。S157A/A239L对活性蓝的脱色率是野生型的2.04倍。加入介体HBT后野生漆酶和突变体对靛蓝和刚果红的脱色效率提高到60%，但对结晶紫和活性蓝无显著效果。 综上，本文通过定点突变有效提高了Melac 13220对底物的转化效率，同时研究了纯化漆酶对各种染料的脱色作用。通过对这种新型嗜热非蓝细菌漆酶的分离和表征及其重要应用的研究，将有助于探索其在工业生产中的应用，扩大现有的生物催化剂范围。
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