摘要
中风是全球致残与致死的主要原因。红花是中医治疗缺血性脑损伤的常用药材，但它的生物活性化合物对内源性神经发生作用在很大程度上还不清楚。因此，探究红花的生物活性成分对内源性神经发生的有益作用对指导其在治疗缺血性中风的应用中至关重要。 目的：本研究探究羟基红花黄色素 A（Hydroxysafflor yellow A，HSYA）在体外对神经祖细胞（Neural progenitor cells，NPCs）增殖分化的生物学特性的影响，并进一步探究其作用机制；体内验证其对内源性神经发生的有益作用及介导机制，用于缺血性脑卒中再灌注损伤的治疗。 方法：（1）研究HSYA在体外对NPCs活力、增殖、分化的影响及其机制，CCK-8 用于评估细胞存活率，经免疫荧光染色、RT-qPCR 和 Western blot 检测，验证 HSYA （10 μM、20 μM 和 40 μM）对 NPCs 增殖、分化的影响。 （2）为了验证 HSYA 对内源性神经祖细胞（Endogenous Neural Progenitor Cells， eNPCs）增殖的促进作用及其机制，经过尾静脉注射 HSYA（10 mg/kg） 7-14 d 的治疗，通过免疫组化评估大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion，MCAO/R）大鼠模型脑室下区（Subventricular Zone，SVZ）、缺血边界区（Ischemic Boundary Zone，IBZ）和缺血核心区（Ischemic Core，IC）Nestin 的表达；Western blot 检测 Nestin、ERK 和 p-ERK 在 MCAO/R 大鼠脑梗死区域的表达情况；为了验证HSYA在体内神经生成和星形胶质细胞的生成作用，通过免疫组化检测大鼠脑部的IBZ区DCX、Tuj-1、和GFAP的表达情况。 （3）在体内实验设计方面，建立了MACO/R大鼠模型，将SD大鼠随机分为Sham组、MCAO/R组和HSYA组。随后，通过神经功能测试、激光散斑成像系统研究HSYA对 MCAO大鼠体内的运动、感觉功能与血流恢复的影响。此外，经过 7-14 d 的尾静脉注射HSYA（10 mg/kg）治疗, 收集各组的 MACO/R 大鼠的大脑进行 TTC 染色、脑含水量评估和组织病理学染色（HE和Nissl）来评估结构和神经功能的修复情况。 结果：（1）用 10 μM、20 μM 和 40 μM 的 HSYA 处理 NPCs 72h 后，可以通过提高PCNA和Ki67的表达量明显以剂量依赖性的方式促进NPCs增殖。在分化培养基中培养 7 d 后，HSYA 以剂量依赖的方式明显上调了 NPCs 中 DCX 和 Tuj-1 的特异性表达以及 GFAP 的特异性表达。这些结果表明，HSYA 可以有效地以剂量依赖的方式诱导NPCs的增殖，并诱导NPCs向神经元和星形胶质细胞分化。此外，HSYA浓度组可以以剂量依赖的方式上调MAPK/ERK途径中的关键蛋白ERK1/2磷酸化水平，总ERK1/2的表达水平没有改变，而这一增殖效果又可被信号通路抑制剂PD98059（PD）所抑制，结果表明，HSYA很可能通过潜在激活MAPK/ERK信号通路介导NPCs增殖。 （2）用 HSYA（10 mg/kg）治疗 7-14 d 后，与 MCAO/R 组相比，HSYA 组大鼠的SVZ、IBZ 和 IC 区中的 Nestin/BrdU阳性细胞明显增加。而且，Western blot 结果表明，与 MCAO/R 组相比，HSYA 处理明显提高了 Nestin 蛋白表达与 ERK1/2 蛋白的磷酸化，而对总 ERK1/2 蛋白表达水平没有影响。这些结果表明，HSYA 可以通过激活MAPK/ERK途径中的p-ERK1/2蛋白来促进SVZ、IBZ和IC区中NPC的增殖。此外， HSYA还能促进SVZ、IBZ和IC区eNPCs的增殖，以及MCAO/R大鼠IBZ区中的神经元和星形胶质细胞的分化。 （3）经过 HSYA（10 mg/kg）治疗 7-14 d 后，HSYA 明显改善了缺血性中风大鼠神经损伤缺陷、运动障碍，损伤侧血流量下降的情况，显著加速了神经与运动功能的恢复过程，增加脑血流量，最终促进了体内实验性中风大鼠模型的神经和运动功能重建。 结论：在体外和体内，HSYA 通过促进 NPCs 的增殖和分化而达到神经发生的作用。本研究表明，HSYA具有显著的神经保护作用，改善MCAO/R大鼠行为和运动功能，降低脑含水量与梗死体积。更重要的是，HSYA 可以有效地促进缺血性中风大鼠NPCs的增殖和内源性神经发生，至少部分是通过MAPK/ERK信号通路。我们的工作为HSYA作为一种诱导内源性神经发生的天然小分子药物提供了有力的支持，同时也为中风后脑修复和再生医学揭示了一个新的治疗目标。
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