摘要
柴胡皂苷是中药柴胡的有效成分之一，具有抗炎、抗肿瘤等药理作用。柴胡皂苷是齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，其生物合成途径的上游阶段已经充分解析。而中游阶段鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase，SE)催化角鲨烯环氧化生成2,3-氧化鲨烯过程，和下游细胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)氧化修饰骨架β-香树脂醇的过程没有被充分解析。本课题以柴胡皂苷生物合成途径SE和CYP450为研究对象，分析北柴胡转录组数据，筛选参与柴胡皂苷生物合成途径相关鲨烯环氧酶、细胞色素P450及NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochromeP450reductase或NADPH-dependentcytochromeP450oxidoreductase,CPR或POR)基因，克隆获得全长序列;构建SE、CYP450、CPR酵母表达载体，转化至酿酒酵母;通过酵母功能互补实验验证SE功能;重组酵母诱导发酵、检测表达产物，初步验证CYP450、CPR的功能。 研究成果如下: (1)获得4条北柴胡鲨烯环氧酶基因全长cDNA序列，分别命名为BcSE1、BcSE2、BcSE3和BcSE4,分别编码527、525、527、530个氨基酸;多重序列比对显示，BcSE1、BcSE2、BcSE3和BcSE4基因的编码蛋白均含有鲨烯环氧酶基因家族的FAD结合基序和底物结合基序;成功构建了pESC-His-BcSEs真核表达载体，使用erg1缺陷酵母进行功能互补实验，BcSE1、BcSE2、BcSE3及BcSE4均能补充erg1突变菌缺失的鲨烯环氧酶功能，说明BcSE1、BcSE2、BcSE3及BcSE4具有鲨烯环氧酶催化活性。 (2)获得52条北柴胡细胞色素P450基因全长cDNA序列，编码458-568个氨基酸;本课题得到的52个北柴胡CYP450中，有49个具有FxxGxRxCxG基序，51个具备AGxDTT基序，均具有ExxR、PER保守基序;得到的北柴胡CYP450系统进化分析，分属于CYP71、CYP76、CYP716、CYP72等多个家族;获得52个pESC-His-CYP450重组酵母表达载体，进行酵母体内功能验证，转入pESC-His-Bc1768质粒的酵母发酵产物中检测到了β-香树脂醇的C-28位羟基化产物——高根二醇，并通过体外酶促反应进一步验证。Bc1768催化β-香树脂醇的C-28位发生羟基化反应。 (3)克隆获得2条北柴胡NADPH-细胞色素P450还原酶。Bc2240长度为2133bp，编码710个氨基酸;Bc2583长度为2055bp,编码684个氨基酸。Bc2240、Bc2583都属于NADPH-细胞色素P450还原酶家族，具有FAD结合、FMN结合和NADPH结合保守基序。Bc2240、Bc2583分别与Bc1768共表达，转入Bc2240、Bc2583重组质粒的酵母发酵产物中均检测到了高根二醇，说明Bc2240、Bc2583具有CPR催化活性。 本课题对柴胡皂苷生物合成途径相关的的鲨烯环氧酶、细胞色素P450、NAPDH-细胞色素P450还原酶基因进行克隆，获得多条序列;获得了4个北柴胡鲨烯环氧酶、1个北柴胡β-香树脂醇C-28位羟化酶、2个北柴胡NAPDH-细胞色素P450还原酶。Bc1768是北柴胡中第一个具有催化功能的CYP450。本课题为柴胡皂苷下游生物合成途径解析提供基础。
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