摘要
目的:红曲是通过红曲霉(Monascus）发酵大米生产的，在中国传统上用作医药和食品已有数千年的历史。目前，被广泛应用于食品、医疗、化妆品、酿造、保健品和生物催化等领域，已经上市销售的药品有脂必妥和血脂康等。但是红曲霉在发酵过程中产生的次级代谢产物桔霉素有肾毒性、致畸性、致癌性和致突变性，为此世界各国对红曲产品的生产及进出口制定了严格的管制措施。至今，红曲霉中桔霉素调控机制尚不完全清楚，本研究通过构建红曲霉CRISPR/Cas9基因编辑体系，结合基因过表达和转录组分析，主要对桔霉素代谢相关基因簇中功能未知基因的作用开展研究，有效消减桔霉素的产生，为红曲霉产品的安全性提供理论依据。 方法: 1.通过农杆菌介导遗传转化，构建Cas9过表达的红曲霉底盘菌株。然后体外合成靶标基因的定向打靶sgRNA,通过PEG介导的原生质体遗传转化，将sgRNA导入底盘菌株，实现对靶标基因的定向编辑，转基因阳性菌株通过靶标基因克隆、T7EI酶切和测序进行验证。 2.构建靶标基因的丝状真菌过表达载体，通过农杆菌介导遗传转化，实现靶标基因在红曲霉中过表达，通过GUS染色、PCR扩增进行检验。 3.对过表达菌株和基因编辑菌株的胞内外桔霉素、色素和洛伐他汀等代谢产物分别采用HPLC和紫外分光光度计进行检测。 4.对过表达菌株与野生型进行转录组测序分析，对桔霉素相关重要基因的转录水平通过qRT-PCR进行验证。 5.通过网络药理学和分子对接方法探讨桔霉素致毒的可能作用机制。 结果: 1.在培养液中添加尿嘧啶核苷（Ud）后对桔霉素有消减作用，30g/L的Ud可以使桔霉素含量降低37.5％。转录组与qRT-PCR数据显示，桔霉素相关基因CtnA、CtnD、CtnE、CtnF、pksCT的表达量显著上调，而桔霉素合成关键成分乙酰CoA的相关基因表达量显著下调，推测Ud通过调控乙酰CoA类化合物的代谢影响桔霉素合成。 2.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了尿嘧啶核苷合成关键酶基因pyrG突变的4个菌株，其中2株单碱基缺失，2株2碱基缺失。与野生型菌株相比,pyrG突变株中桔霉素和洛伐他汀都有增加，表明pyrG对红曲霉的次生代谢有影响。 3.CtnD基因编辑获得的突变菌株发生了单碱基或3碱基缺失，导致蛋白质翻译错误，胞内及胞外桔霉素含量分别减少了91％和98％以上。而CtnD过表达菌株的胞内和胞外桔霉素含量分别增加了31％和67％,红曲色素、黄色素、橙色素和洛伐他汀均有不同程度的增加。转录组与qRT-PCR数据显示，CtnD高表达时CtnB、CtnE、CtnF、pksPT、MpigE的表达无明显变化，但酰基辅酶A、氨肽酶和1个功能未知MFS蛋白显著高表达，推测CtnD基因是桔霉素代谢中的关键基因之一。 4.获得的Mrr2（即CtnF的同源基因）过表达菌株与野生型相比，Mrr2过表达导致菌丝中桔霉素含量增加高达150.82％,洛伐他汀和色素含量均有不同程度增加。qRT-PCR显示，Mrr2过表达对其它桔霉素相关基因的表达有明显促进作用。 5.通过网络药理学分析，获得桔霉素与“livertoxicity”和“kidneytoxicity”相关的潜在靶点110个，GO富集分析功能条目496条，KEGG信号通路富集靶点数和显著性均较高的是肿瘤MicroRNA、肿瘤、乙型肝炎等通路。分子对接证明桔霉素可能通过TP53、CASP3、MAPK3和ALB等关键靶点导致肝肾毒性，揭示了桔霉素导致肝肾毒性的潜在作用靶点和信号通路。 结论: 1、证明了外源添加Ud对桔霉素的合成有明显抑制作用，以Ud合成酶基因pyrG为标记基因，成功构建了体外sgRNA对红曲霉Cas9底盘菌株定向基因编辑的技术体系。 2、证明CtnD和Mrr2的表达与桔霉素合成显著正相关，可能是桔霉素合成途径中的关键酶，CtnD突变能消减桔霉素90％以上。 3、通过网络药理学和分子对接，发现桔霉素可能通过TP53、CASP3、MAPK3和ALB等关键靶点导致肝肾毒性。
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