摘要
目的:明确杜鹃兰假鳞茎叶芽选择性生长的主要信号分子，筛选杜鹃兰假鳞茎叶芽选择性生长关键蛋白，探讨杜鹃兰假鳞茎单叶芽选择性生长机制，为攻克杜鹃兰假鳞茎繁殖系数低的瓶颈问题提供新思路。 方法:1.以一年生杜鹃兰假鳞茎为材料，采用形态学观测杜鹃兰假鳞茎叶芽生长发育，结合生理生化指标剖析单叶芽生长规律;2.采用iTRAQ标记的定量蛋白质组学检测手段，表征休眠期休眠芽、萌发期萌发芽、伸长期生长芽和受抑制芽蛋白质的表达特性，比较研究获得差异表达蛋白。进一步对感兴趣的差异表达蛋白，通过GO富集、KEGG代谢通路等分析方法，进行数据深入挖掘，推测假鳞茎单叶芽选择性生长的调控途径和代谢通路，结合文献调研，确定候选关键调控蛋白;3.以相同方法收集第二年样品，随机选取9个差异表达蛋白，采用PRM靶向定量蛋白检测技术，对蛋白质组学分析结果进行验证;4.针对预测调控通路上的关键基因、蛋白质、潜在的信号分子及小分子糖（蔗糖、葡萄糖和海藻糖），采用qRT-PCR、PRM、HPLC/MS和相应检测试剂盒检测方法，从基因-蛋白-生理活性成分进行表征，探讨它们之间的互动关系，初步阐述杜鹃兰单叶芽生长调控机制。 结果:1.通过形态学观察，发现杜鹃兰假鳞茎上的叶芽生长存在某种选择生长的调控方式，即从其假鳞茎中的众多叶芽中选择1个叶芽生长，长成一个新的假鳞茎。2.通过光镜和电镜显微观测，结合宏观观察，发现杜鹃兰假鳞茎叶芽从启动生长至选择继续生长，经历3个重要时期，即休眠期、萌发期和伸长期;经过宏微观比较分析，可将三个时期叶芽分成4种不同表型叶芽，即休眠芽（Dor）、萌发芽（Ger）、继续生长芽（Bre_Y）和受抑制芽（Bre_N）。3.通过对植物生长发育相关重要成分（糖类、蛋白质、植物激素）进行检测分析，结果表明，相比休眠期，萌发期叶芽中的淀粉含量显著低于休眠期（P＜0.05），而其水解酶活力显著提高（P＜0.05）;萌发期叶芽中可溶性糖和水溶性蛋白显著高于休眠期（P＜0.05）;植物激素检测分析发现，在休眠期不同位置上的叶芽，除ABA在上端叶芽显著低于下端叶芽之外（P＜0.05），其它激素（IAA、CK、GA3）有差异，但不显著。4.对收集的4个表型叶芽进行蛋白质组学分析，共获得2398个差异表达蛋白;对上调差异表达蛋白进行GO富集、KEGG代谢通路分析，发现GerVSDor细胞成分显著富集在质体、线粒体、叶绿体等条目，生物学过程显著富集在脂类氧化代谢、植物器官形成条目，分子功能显著富集在乙酰辅酶A乙酰转移酶活性条目，KEGG富集分析显著富集在脂肪酸降解途径;Bre_YVSGer细胞成分显著富集在细胞器连接位点、蛋白质-DNA复合物等条目，生物学过程显著富集在能量储存代谢过程、与糖分解代谢相关等条目，分子功能显著富集在磷酸葡萄糖变位酶活性、RNA结合等条目，KEGG显著富集在淀粉和蔗糖代谢等途径;Bre_YVSBre_N细胞成分显著富集在共质体、胞间连丝、细胞间连接等条目，生物学过程显著富集在生长素代谢过程、干细胞命运决定、植物激素生物合成过程、单维细胞生长过程、分生组织维护等条目，分子功能显著富集在催化活性、连接酶活性等条目，KEGG显著富集在泛素介导的蛋白质水解等代谢途径。蛋白质组学结果与PRM靶向定量蛋白检测结果对比分析，发现选择的9个蛋白表达特征高度一致，说明蛋白质组学检测结果准确、可靠。5.挑选与杜鹃兰假鳞茎单叶芽生长生物过程匹配度高的条目进一步深入分析，结果聚焦在2个糖代谢蛋白HXK1和TPS,1个生长素内平衡调节蛋白DAO,1个生长素响应蛋白ARF，以及2个生长素运输蛋白PIN和TRS31。6.我们通过qRT-PCR表征，HXK1、TPS基因在Bre_Y中表达量显著高于Ger与Bre_N;PRM表征，TPS蛋白在Bre_Y中表达水平分别是Bre_N、Ger中的3.65和1.70倍。相应小分子糖检测结果显示，从Dor-Ger-Bre_Y1-Bre_Y2-Bre_Y3蔗糖水平先快速下降，再缓慢下降;葡萄糖水平先快速下降，再保持一定水平，再快速升高;海藻糖水平先快速下降，再持续升高，再迅速下降。然而，Dor-Ger-Bre_N1-Bre_N2-Bre_N3蔗糖水平变化趋势相对一致，葡萄糖趋于稳定在0.5mg/g水平，海藻糖趋于稳定在100mg/g水平;结果提示，小分子糖可能参与了杜鹃兰假鳞茎叶芽生长的选择。7.qRT-PCR分析结果表明，PIN和DAO基因在Bre_Y中表达量显著高于Bre_N(P＜0.05)，PRM检测结果表明，PIN和DAO蛋白在Bre_Y表达丰度显著高于Bre_N，HPLC/MS结果表明，IAA和OXIAA在Bre_Y中保持较高水平，却在Bre_N中保持相对较低水平，提示IAA不均衡分布是促进杜鹃兰假鳞茎叶芽生长的动力。 结论:推测杜鹃兰假鳞茎单叶芽生长是通过HKX1介导TPS信号转导途径选择叶芽生长;DAO蛋白通过催化氧化活性IAA的方式，调节杜鹃兰假鳞茎叶芽中活性IAA水平，同时依赖PIN蛋白对其生长叶芽中活性IAA的输出，共同作用维持叶芽中活性IAA水平，且最终以低活性IAA水平抑制叶芽生长，较高IAA水平促进叶芽持续生长。
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