摘要
目的: 1.建立对氯苯丙氨酸(Para-chlorophenylalanine,PCPA)失眠大鼠模型，研究脑内5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量下降后海马和前额叶突触可塑性相关蛋白突触素Ⅰ(SynaptophysinⅠ，SynⅠ)、突触后致密蛋白95(Postsynapticdensity95，PSD-95)、神经生长相关蛋白43(Growthassociatedprotein43，GAP-43)以及脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)、神经胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的表达变化，探讨其表现出学习记忆障碍和焦虑样行为的机制。 2.研究酸枣仁汤对PCPA失眠大鼠模型学习记忆障碍和焦虑样行为的影响，探讨酸枣仁汤对海马和前额叶突触可塑性相关蛋白SynⅠ、PSD-95、GAP-43以及BDNF、GFAP的调节作用，为酸枣仁汤治疗失眠引起学习记忆障碍和焦虑情绪提供实验依据。 方法: 将SPF级雄性SD大鼠分为对照组、模型组、酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组、酸枣仁汤低剂量组以及艾司唑仑组，共6组，每组12只。腹腔注射PCPA，按350mg/kg，以10ml/kg体积，每天1次，连续3d,制备PCPA失眠大鼠模型。造模结束后连续给药7d，酸枣仁汤高、中、低剂量分别按15g/kg、7.5g/kg、3.75g/kg，艾司唑仑按2.7×10-4g/kg,均以10ml/kg体积灌胃，每天1次。于给药第3-7d行Morris水迷宫实验观察学习记忆功能，给药第8d行戊巴比妥钠协同睡眠实验观察睡眠情况，给药第9d行高架十字迷宫实验观察焦虑样行为变化。行为学实验结束后取材，每组6只大鼠取新鲜海马和前额叶组织，采用RT-qPCR和Westernblot法检测SynⅠ、PSD-95、GAP-43、BDNF的mRNA和蛋白表达，每组剩余6只大鼠进行心脏灌注，取完整脑组织进行HE染色观察海马和前额叶病理变化，免疫组化法观察海马和前额叶SynⅠ、PSD-95、GAP-43、BDNF、GFAP蛋白表达。 结果: 1.Morris水迷宫实验结果 1.1定位巡航实验结果 与对照组相比，模型组大鼠的逃逸潜伏期时间明显增加（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组、酸枣仁汤低剂量组以及艾司唑仑组大鼠的逃逸潜伏期时间均明显下降（P＜0.01）。 1.2空间探索实验结果 与对照组相比，模型组大鼠的穿越平台次数以及原平台象限活动时间均明显减少（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组以及艾司唑仑组大鼠的穿越平台次数和原平台象限活动时间都明显增加（P＜0.01）,酸枣仁汤低剂量组大鼠的穿越平台次数以及原平台象限活动时间均增加（P＜0.05）。 2.戊巴比妥钠协同睡眠实验结果 与对照组相比，模型组大鼠的入睡潜伏期显著增加（P＜0.01），睡眠持续时间显著缩短（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组和艾司唑仑组大鼠的睡眠持续时间均显著增加（P＜0.01）,入睡潜伏期显著缩短（P＜0.01）,酸枣仁汤中剂量组大鼠的睡眠持续时间增加（P＜0.05），入睡潜伏期缩短（P＜0.01），酸枣仁汤低剂量组大鼠的入睡潜伏期缩短（P＜0.05）。 3.高架十字迷宫实验结果 与对照组相比，模型组大鼠的开放臂停留时间比例以及开放臂进入次数比例都明显下降（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组以及艾司唑仑组大鼠的开放臂进入次数比例均明显增加（P＜0.01）,开放臂停留时间比例有不同程度增加（P＜0.05），酸枣仁汤中剂量组以及酸枣仁汤低剂量组大鼠的开放臂进入次数比例均有所增加（P＜0.05），酸枣仁汤中剂量组和酸枣仁汤低剂量组大鼠开放臂停留时间比例有所增加，但差异没有统计学意义（P＞0.05）。 4.HE染色结果 4.1海马HE染色结果 对照组大鼠海马椎体神经元形态规则呈圆形或椭圆形，排列紧密呈条带状，胞浆丰富核仁清晰;与对照组相比，模型组大鼠海马椎体神经元细胞间隙增宽，排列稀疏，胞体较大，胞浆红染核仁模糊;与模型组比较，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组、酸枣仁汤低剂量组以及艾司唑仑组大鼠的椎体神经元形态较规则，排列较规整，染色较清晰。 4.2前额叶HE染色结果 对照组大鼠前额叶神经元呈锥形或椭圆形，排列紧密，着色均匀为浅蓝或紫色，核仁明显，结构完整，轮廓清晰;与对照组相比，模型组大鼠的神经元轮廓与周围组织区分欠清晰，染色视野较模糊，细胞间隙变宽，分布杂乱无序形态不一，突起减少，细胞肿胀;与模型组比较，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组、酸枣仁汤低剂量组以及艾司唑仑组大鼠的神经元形态结构有所改善，染色较清晰，排列较规整。 5.免疫组化结果 5.1海马CA1区SynⅠ、PSD-95、GAP-43免疫组化结果 与对照组相比，模型组大鼠海马CA1区SynⅠ、PSD-95以及GAP-43的平均光密度值均显著降低（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组和艾司唑仑组大鼠海马CA1区SynⅠ、PSD-95以及GAP-43的平均光密度值均明显增加（P＜0.01），酸枣仁汤低剂量组大鼠海马CA1区SynⅠ的平均光密度值明显增加（P＜0.01）,PSD-95以及GAP-43的平均光密度值均有所增加（P＜0.05）。 5.2前额叶GFAP、BDNF、PSD-95、GAP-43免疫组化结果 与对照组相比，模型组大鼠前额叶GFAP平均光密度值明显增加（P＜0.01）,BDNF、PSD-95以及GAP-43平均光密度值均明显减少（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组、酸枣仁汤低剂量组和艾司唑仑组大鼠前额叶的BDNF、PSD-95以及GAP-43平均光密度值均有不同程度增加（P＜0.05,P＜0.01），GFAP平均光密度值均有不同程度减少（P＜0.05，P＜0.01）。 6.Westernblot实验结果 6.1海马SynⅠ、PSD-95、GAP-43蛋白表达结果 与对照组相比，模型组大鼠海马SynⅠ、PSD-95以及GAP-43的蛋白表达均明显减少（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组、酸枣仁汤低剂量组、艾司唑仑组大鼠海马SynⅠ、PSD-95以及GAP-43的蛋白表达均有不同程度增加（P＜0.05，P＜0.01）。 6.2前额叶BDNF、PSD-95、GAP-43蛋白表达结果 与对照组相比，模型组大鼠前额叶BDNF、PSD-95以及GAP-43的蛋白表达均明显减少（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组、酸枣仁汤低剂量组、艾司唑仑组大鼠前额叶BDNF、PSD-95以及GAP-43的蛋白表达均有不同程度增加（P＜0.05,P＜0.01）。 7.RT-qPCR实验结果 7.1海马SynⅠ、PSD-95、GAP-43mRNA表达结果 与对照组相比，模型组大鼠海马SynⅠ、PSD-95以及GAP-43的mRNA表达均明显下降（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组和艾司唑仑组大鼠海马SynⅠ、PSD-95以及GAP-43的mRNA表达均明显增加（P＜0.01），酸枣仁汤低剂量组大鼠海马GAP-43的mRNA表达明显增加（P＜0.01）,SynⅠ以及PSD-95的mRNA表达均有所增加（P＜0.05）。 7.2前额叶BDNF、PSD-95、GAP-43mRNA表达结果 与对照组相比，模型组大鼠前额叶BDNF、PSD-95以及GAP-43的mRNA表达均明显下降（P＜0.01）;与模型组相比，酸枣仁汤高剂量组、酸枣仁汤中剂量组和艾司唑仑组大鼠前额叶BDNF、PSD-95以及GAP-43的mRNA表达均明显增加（P＜0.01），酸枣仁汤低剂量组大鼠前额叶GAP-43的mRNA表达明显增加（P＜0.01），BDNF以及PSD-95的mRNA表达有所增加（P＜0.05）。 结论: 1.PCPA失眠大鼠表现出的学习记忆障碍和焦虑样行为与脑内5-HT含量下降导致的海马和前额叶损伤有关，其中涉及到海马突触可塑性相关蛋白SynⅠ、PSD-95、GAP-43表达变化，以及前额叶星形胶质细胞、BDNF、PSD-95、GAP-43的表达变化。 2.PCPA失眠大鼠模型与中医肝郁血虚型失眠症候较相符，肝郁血虚症候是失眠与学习记忆障碍、焦虑情绪的重要共病机制。酸枣仁汤配伍中所体现的养血安神功效是缓解PCPA失眠大鼠所表现出的学习记忆障碍以及焦虑样行为的有效方法，与上调海马突触可塑性相关蛋白SynⅠ、PSD-95、GAP-43;抑制前额叶星形胶质细胞活化，并增加前额叶BDNF、PSD-95以及GAP-43表达有关。
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