摘要
抗生素可显著减少严重细菌感染导致的死亡。然而，抗生素的过度使用和误用不可避免地导致抗生素耐药性的出现。新抗生素的开发速度下降，这使得在后抗生素时代，治疗选择面临威胁。尽管耐药性不断增加，四环素类抗生素仍然是临床和畜牧业中使用最广泛的抗生素之一。一、二代四环素类耐药性在细菌中非常常见，尤其是在食品源动物细菌中，耐药率超过80%。编码四环素外排泵tet(A)基因在肠杆菌科细菌中较为流行。替加环素是新型四环素类抗生素，能够克服一二代四环素类耐药机制如外排泵Tet(A)。虽然替加环素并未批准用于畜牧养殖业，但近年来动物源替加环素耐药菌株不断出现，如介导替加环素高水平耐药的tet(X4)基因。此外，tet(A)突变体基因介导替加环素敏感性下降或耐药的现象也有零星报道。本研究通过分析不同动物源肠杆菌科细菌中tet(A)突变体的流行情况及其耐药特征，探索tet(A)突变体对替加环素耐药性的影响，为制定肠杆菌科细菌感染的治疗策略提供理论依据。 本试验收集了332株分离自河南省不同动物源肠杆菌科细菌，主要包括大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。通过PCR扩增筛选得到177株携带tet(A)突变体的阳性肠杆菌，其中宠物源阳性分离株29株，鸡源阳性分离株30株，猪源阳性分离株118株。药敏试验结果显示，177株tet(A)突变体阳性肠杆菌均为多重耐药菌株，其中对四环素、多西环素、氟苯尼考耐药率较高，在88.7%~97.7%之间，对美罗培南耐药率较低，为0.6%。177株tet(A)突变体阳性肠杆菌中有39株分离株对替加环素耐药（22.0%），其中宠物源分离株28株，即对替加环素耐药率达96.56%，耐药情况严重。同时该宠物源分离株对环丙沙星、黏菌素、头孢他啶、头孢喹肟、头孢噻肟等耐药情况也十分严峻。 对39株tet(A)突变体阳性替加环素耐药肠杆菌进行其他耐药基因检测，如替加环素耐药基因tet(X)变异体和tmexCD-toprJ，黏菌素耐药基因mcr，头孢菌素类耐药基因blaCTX-Ms，碳青霉烯类耐药基因blaNDM和blaKPC，磷霉素耐药基因fosA3以及四环素耐药基因tet(M)等，结果表明这些tet(A)突变体阳性分离株还同时携带tet(X4)、fosA3、blaCTX-M、blaNDM或mcr-1等。对其中22株不携带其他替加环素耐药基因的菌株进行种属鉴定，结果显示，有20株分离株为大肠杆菌，2株分离株为肺炎克雷伯菌。该20株为大肠杆菌分离株，其中19株为宠物源分离株，1株为鸡源分离株；2株肺炎克雷伯菌，分别为宠物源和猪源分离菌株。对其进行接合试验，有3株接合成功，包含一株鸡源大肠杆菌、一株宠物源大肠杆菌及一株宠物源肺炎克雷伯菌，即成功获得tet(A)突变体阳性接合子。药敏试验结果显示，获得的这些接合子均对替加环素耐药。值得注意是，在这3株接合成功的tet(A)突变体阳性肠杆菌中，一株鸡源tet(A)突变体阳性大肠杆菌R2介导替加环素高水平耐药（MIC=16μg/mL），其对应的接合子（MIC=4μg/mL）相较于受体菌E.coliC600（MIC=0.125μg/mL）对替加环素的敏感性降低了32倍。 对大肠杆菌R2及其接合子进行高通量测序。序列分析发现，大肠杆菌R2携带三个质粒，分别为pR2-1（323Kb）、pR2-2（168Kb）和pR2-3（97Kb）。质粒pR2-1属于IncHI2/IncHI2A质粒，除了携带tet(A)突变体外，还携带floR、nrS1、lnu(G)、rmtB、aada22、aac(3)-Ⅱd、aph(6)-Id、aph(3'')-Ia、arr-2、sμl3、fosA3、dfrA14、mph(A)、blaTEM、blaLAP-2和blaCTX-M-55等耐药基因。质粒pR2-2属于IncFIB/IncFⅡ质粒,不携带任何耐药基因；质粒pR2-3属于IncFⅡ(pHN7A8)/IncX1质粒，携带tet(A)、aph(6)-Id、aph(3'''')-Ib、floR、sul2、blaTEM和blaCTX-M-55等耐药基因。质粒pR2-1上的tet(A)突变体位于转座子TnAs1中。反向PCR结果显示，转座子TnAs1能够环化形成中间体，介导tet(A)突变体在质粒之间进行转移。对接合子中质粒的序列进行分析发现，转座子TnAs1介导tet(A)突变体在质粒pR2-3中重复插入，其拷贝数成多样性。S1-PFGE进一步证实了tet(A)突变体不同拷贝数的重复插入。tet(A)突变体克隆试验显示，与携带空载体pUC18的E.coliDH5αpUC18（0.25μg/mL）相比，携带重组质粒pUC18-tet(A)v的转化子DH5αpUC18-tet(A)v的MIC（1μg/mL）升高了4倍。此外，与受体菌E.coliC600相比，携带一个tet(A)突变体拷贝的质粒pT16R-1的接合子的MIC升高了4倍。这些结果表明单一的tet(A)突变体能够介导菌株对替加环素的敏感性下降，而tet(A)突变体发生串联后表达量增加，从而介导替加环素高水平耐药。荧光定量PCR进一步证实了大肠杆菌R2的接合子中tet(A)突变体的过表达。菌株生长曲线的测定和质粒的稳定性试验表明，这种tet(A)突变体在质粒中的串联插入，对菌株的生长影响较小，且不影响质粒的稳定性。耐药发展试验表明，tet(A)突变体串联介导的替加环素耐药性较稳定，且在药物压力下，对替加环素耐药性能够继续增长。 综上所述，不同动物源携带tet(A)突变体的阳性肠杆菌多重耐药现象严重，其中宠物源肠杆菌科细菌替加环素耐药性较为严重，部分tet(A)突变体阳性肠杆菌同时携带其他耐药基因。不携带其他替加环素耐药基因的tet(A)突变体阳性肠杆菌中，其接合子均对替加环素耐药。研究发现，可介导替加环素高水平耐药（MIC=16μg/mL）的一株鸡源tet(A)突变体阳性大肠杆菌R2，其质粒pR2-1上的tet(A)突变体位于转座子TnAs1中，转座子TnAs1能够环化形成中间体，介导tet(A)突变体在质粒之间进行转移及在质粒pR2-3中不同拷贝数重复插入，从而影响替加环素耐药性。此外，单一的tet(A)突变体仅能介导菌株对替加环素的敏感性下降，而tet(A)突变体的过表达能够介导替加环素高水平耐药，且在药物压力下，对替加环素耐药性能够继续增长。tet(A)突变体串联极有可能成为替加环素耐药性广泛传播的途径之一，持续检测tet(A)突变体的流行情况，对保障动物健康、维护公共卫生安全十分重要。
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