摘要
绵羊球虫病是由艾美耳属的原生动物引起的一种常见的肠道疾病，主要引起腹泻以及体重减轻等症状。动物健康状态是影响其对球虫易感性的重要因素。先前有研究证实，霉菌毒素可以影响家禽对球虫的易感性。由于球虫对宿主特异性以及动物物种的不同，尚不清楚霉菌毒素是否干扰绵羊对球虫的易感性。黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种已知的强致癌物，它广泛存在于环境、土壤、粮食作物和动物饲料中。研究已证实，它对人类和动物的健康有负面影响。作为抵御有害物质进人机体内环境的第一道屏障，肠道不仅是AFB1的主要暴露部位，还是球虫发育和繁殖的场所。因此，本研究使用绵羊作为动物模型来深入探究AFB1和球虫联合作用时是否影响球虫单独作用时对肠道结构以及功能的破坏，同时基于蛋白组学挖掘AFB1和球虫之间相互作用的复杂机制。首先使用抗球虫药物地克珠利处理羔羊两周，从中挑选20只健康未感染球虫的雌性羔羊作为受试对象。随后，随机分为4组，每组5只羔羊：对照组（CON）、AFB1组（AFB1）、类绵羊艾美耳球虫（Eimeriaovinoidalis）组（EO）和AFB1+类绵羊艾美耳球虫组（EO+AFB1），试验周期为15天。其中，EO组和EO+AFB1组在试验第一天灌服2×104个孢子化卵囊。AFB1和EO+AFB1组灌服AFB1溶液（60μg/kg体重的AFB1，溶于2%DMSO溶液），其余两组灌服等体积、等浓度的DMSO溶液，连续灌服14天。探究AFB1与球虫共同存在下对羔羊肠道损伤的潜在作用机制。 研究一：AFB1暴露对球虫感染下羔羊肠道屏障的影响 选取CON组、EO组、AFB1组和EO+AFB1组肠道样本进行组织病理学观察，然后通过阿利新蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色、PAS染色、免疫荧光和蛋白免疫印迹（WB）技术分析肠道通透性的变化。 （1）AFB1的暴露影响了球虫感染羔羊粪便中卵囊的数量及球虫的发育过程。与EO组相比，EO+AFB1组羔羊卵囊排出的高峰期提前，并且减少高峰期时粪便卵囊排出的数量。 （2）AFB1和球虫联合作用可以严重破坏盲肠组织。通过组织病理学观察，发现两种因素的联合作用主要导致了羔羊盲肠结构的严重破坏，造成盲肠隐窝的破坏以及出血，并且严重减少盲肠粘膜的厚度。进一步采用AB-PAS和PAS染色评估肠道杯状细胞的数量和分泌，同时免疫荧光和WB技术检测肠道通透性的关键蛋白（紧密连接蛋白）的表达水平。结果发现，与EO组和AFB1组相比，EO+AFB1组羔羊盲肠中杯状细胞数量和粘蛋白的表达水平被进一步降低（p＜0.05）。同时，与EO组相比，EO+AFB1组羔羊盲肠中紧密连接蛋白Occludin的蛋白表达水平也被进一步抑制（p＜0.001）。 研究二：AFB1暴露对球虫感染羔羊肠道菌群稳态以及全身免疫的影响 （1）AFB1加重球虫对肠道菌群稳态的影响。对各组羔羊盲肠内容物进行16SrRNA测序分析，发现在AFB1存在下加重球虫对肠道菌群多样性和丰富度的影响。与CON组相比，EO组羔羊盲肠表现为一种产生丁酸盐的Oscillospira（颤螺菌属）相对丰度的降低，并且在AFB1暴露下（EO+AFB1组）进一步减少（0.0015vs0.0057vs0.0103）。通过检测盲肠中短链脂肪酸的含量，结果显示与CON组相比，EO组盲肠中乙酸（48.53vs453.8vs1088）、丙酸（4.068vs84.48vs280.2）、丁酸（0.9567vs54.95vs179.3）、异丁酸（0vs10.09vs23.15）、戊酸（0vs6.083vs21.08）和异戊酸（0vs11.57vs21.13）的含量均有所下降，当同时暴露于AFB1时，这些短链脂肪酸的含量进一步降低。通过Spearman分析发现Oscillospira（颤螺菌属）与肠道中6种短链脂肪酸均呈较强的正相关（R＞0，p＜0.05）。 （2）AFB1加重球虫对肠道炎症的影响。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）发现，与CON组相比，EO组可显著诱导TLR4和NF-kB基因水平的表达（p＜0.05）。然而，AFB1减弱了球虫对羔羊盲肠中TLR4和NF-kB基因表达水平的影响（p＞0.05）。同时，球虫对羔羊IL-6和TNF-α基因表达、IL-17A和IFN-γ含量的影响因AFB1的存在而加剧（p＜0.001），这可能是肠道菌群的紊乱以及肠道屏障的破坏，造成脂多糖（LPS）通过肠道屏障进入血液循环，引起全身的免疫反应。此外，试验检测血浆中LPS含量发现，EO+AFB1组羔羊血浆LPS含量降低显著低于EO组（p＜0.01）。同时也发现EO+AFB1组羔羊血浆中全身免疫相关指标IL-6、IL-17A、IFN-γ和TNF-α的水平低于EO组。 研究三：AFB1暴露加重球虫对羔羊肠道损伤的分子机制 （1）为探讨AFB1暴露加重球虫对羔羊肠道损伤的分子机制，试验运用蛋白质组学测序技术分析羔羊盲肠中关键蛋白的变化。结果显示氧化磷酸化通路的抑制是两种致病因素发挥肠道损伤作用的关键通路，并且富集在这条通路的蛋白大部分是线粒体复合物I（促进NADH向NAD+的转化）的亚基。通过ELISA和WB检测发现，与CON组相比，EO组的NADH与NAD+的比率（0.9434vs0.7464vs0.2825）升高，并且在AFB1的作用下该指标发生更明显的改变。同时，通过WB检测细胞能量感受器AMPK磷酸化水平。结果显示，与EO组相比，EO+AFB1组p-AMPK和AMPK的比率增加（p＜0.01）。此外，通过qRT-PCR发现，AFB1暴露下促进球虫对PGC-1α/NRF1轴的抑制表达从而导致线粒体功能障碍。 （2）线粒体在细胞凋亡中也起着重要作用。细胞凋亡是细胞死亡的主要方式，受许多促细胞凋亡基因（Bax、caspase-3和caspase-9）和抗细胞凋亡基因（Bcl-2）的调控。通过qRT-PCR发现，AFB1的存在促进球虫对Bcl-2与Bax的比率的降低作用。这可能是两种因素联合作用下羔羊卵囊排出高峰期提前的重要原因。 综上所述，AFB1暴露时会加重球虫对肠道形态、肠道屏障功能、肠道菌群稳态、肠道炎症以及全身免疫的影响。此外，AFB1暴露下引起球虫感染羔羊的卵囊排出高峰期提前以及卵囊排出量的降低，这与AFB1加重球虫对羔羊肠道细胞的破坏以及促进细胞的凋亡密切相关。这些结果为AFB1参与类绵羊艾美耳球虫引起的羔羊肠道损伤提供新的见解以及靶向肠线粒体氧化磷酸化途径可能是干预霉菌毒素和球虫有害作用的潜在治疗策略。
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