基于肠道-血液-生殖轴探究黄曲霉毒素B1和球虫联合对绵羊子宫的毒性作用

扫码查看

原文链接

NETL

中文摘要：谷物和动物饲料在世界范围内经常受到霉菌毒素污染，黄曲霉毒素是最常见的霉菌毒素之一，摄入后影响机体各器官的功能，严重威胁着畜禽的健康。球虫病是一种绵羊常发的传染性寄生虫病，主要导致幼龄动物腹泻和生长迟缓，极大地限制了绵羊养殖业的发展。黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）暴露已被证明能够破坏动物生殖系统功能，然而，联合球虫感染对反刍动物生殖系统的损害尚未被关注。因此，本研究以绵羊为大型动物模型，探究AFB1和球虫联合通过肠道-血液-生殖轴对绵羊生殖系统的毒性作用。随机挑选100只35日龄健康断奶母湖羊，灌服地克珠利溶液1mg/kg，每日一次连续两天，驱除可能感染的球虫。用药后第11天对每只绵羊进行直肠采样并显微镜检测，连续检测3天。最终选取16只体重在8-12kg无球虫感染的健康雌性湖羊，随机分为对照组（Con）、AFB1暴露组（AFB1）、球虫组（E.o）和联合处理组（AFB1+E.o）。Con组灌服等量DMSO和生理盐水。AFB1组灌服AFB160μg/kg。E.o组灌服2×104孢子化卵囊（仅第0天）。AFB1+E.o组灌服AFB160μg/kg+2×104个孢子化卵囊（仅第0天），连续处理14天。主要研究内容与结果如下：研究一：AFB1和球虫联合对绵羊子宫损伤的作用首先，绵羊的生长性能及卵囊数量和粪便形态分析结果证明AFB1和球虫模型的成功建立。绵羊子宫形态学和组织学结果显示，AFB1和球虫单独或联合作用导致子宫内膜上皮细胞紊乱、炎性细胞浸润和充血。荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示，与Con组相比，AFB1和球虫处理显著下调绵羊子宫组织中雌激素受体ERα（p=0.021）和ERβ（p=0.021），和抗炎因子IL-10（p=0.016）的mRNA表达水平，上调促炎因子IL-6（p=0.003）和TNF-α（p＜0.001）mRNA表达水平。以上结果表明AFB1和球虫联合作用对生殖系统的毒性作用可能与子宫激素的改变和炎症的诱发有关。研究二：AFB1和球虫联合对绵羊肠道健康的影响通过对绵羊肠道组织病理学观察发现，AFB1和球虫联合诱导肠道屏障结构的损伤。绵羊粪便16SrRNA测序分析发现，AFB1和球虫处理导致肠道菌群紊乱，其中类杆菌属（Bacteroides）、经黏液真杆菌属（Blautia）、优杆菌属（[Eubacterium]）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、刺骨鱼属菌（Epulopiscium）、琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）存在显著的组间差异。粪便代谢组学分析显示，AFB1和球虫联合组绵羊粪便代谢物与Con组存在显著差异，并且筛选出的14个共有的差异代谢物与类杆菌属（Bacteroides）、优杆菌属（[Eubacterium]）、刺骨鱼菌属（Epulopiscium）和肠屏障指标Claudin1、Claudin4和Occludin呈现显著正相关，与经黏液真杆菌属（Blautia）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和ZO-1呈现负相关。以上结果表明，AFB1和球虫联合可能是通过干扰肠道菌群组成及其代谢物引起绵羊肠道屏障功能障碍。研究三：AFB1和球虫联合对绵羊血液指标的影响为进一步阐明AFB1和球虫单独或联合诱导的子宫损伤与肠屏障受损之间的关联机制，首先采用ELISA方法检测血液中的炎症因子的表达水平。AFB1和球虫处理显著上调促炎因子IL-6、TNF-α的表达水平（allp＜0.05）和LPS的表达水平（allp＜0.05），显著下调抗炎因子IL-10（allp＜0.05）的表达水平。同时显著增强血液中雌激素受体ERα和ERβ（allp＜0.05）的表达水平。进一步通过广泛非靶向代谢组学检测血液中代谢产物的变化。根据|Log2FC|≥1和P＜0.05选择差异表达的代谢物，ConvsAFB1组鉴定出402种差异代谢物，ConvsE.o组鉴定出978种差异代谢物，ConvsAFB1+E.o组鉴定出1211个差异代谢物，这些差异代谢物均主要富集在氨基酸代谢途径。将富集在氨基酸代谢途径中的10个代谢物与血液炎症因子及激素相关指标进行皮尔逊相关性分析，发现N-乙酰-L-苯丙氨酸与血液指标之间存在显著的相关性，这表明肠道菌群及其代谢紊乱是由AFB1和球虫作用引起循环中炎症和激素改变的主要原因，其中氨基酸代谢可能是一个主要的促成因素。研究四：AFB1和球虫联合对绵羊子宫损伤的机制通过绵羊子宫组织转录组分析，探讨AFB1和球虫联合对绵羊子宫的潜在损伤机制。根据|Log2FC|＞2，P＜0.05标准筛选差异基因，并通过韦恩图筛选出共有的84个差异基因，与Con组相比，不同的处理组之间这84个差异基因的表达存在明显的差异。KEGG富集分析筛选松弛素信号通路，同时验证了富集在这条通路的基因COL11A1、COL4A4、FOSB和GNG2mRNA的表达水平。与Con组、AFB1+E.o组相比，AFB1组显著上调COL11A1（p=0.002和p＜0.001）和COL4A4（p=0.044和p=0.015）的表达水平。此外，AFB1+E.o组子宫GNG2的表达水平显著高于Con组（p=0.002）；然而，AFB1和球虫单独处理下GNG2的表达水平显著低于AFB1+E.o组（p=0.019和p=0.002）。其中，PI3K/AKT/eNOS信号通路是松弛素信号通路的重要下游通路，该信号通路已被证明可调节细胞增殖和分化，并参与生物体中各种疾病的发展。因此，进一步验证PI3K/AKT/eNOS信号通路在子宫组织上的表达发现，AFB1和球虫处理可激活PI3K（ConvsAFB1，p=0.010；p=0.002）、AKT（ConvsAFB1，p=0.002）、eNOS（ConvsAFB1，p＜0.001；ConvsAFB1+E.o，p＜0.001）基因的表达。这些结果表明，受松弛素信号通路及下游PI3K/AKT/eNOS信号通路参与绵羊子宫病理损伤发生的调控。综上所述，AFB1和球虫联合通过影响绵羊肠道菌群及代谢物的变化损伤肠道屏障功能，并进一步诱发血液循环炎症和激素的变化，同时激活松弛素信号及其下游PI3K/AKT/eNOS通路诱导生殖系统的损伤。这些发现揭示基于肠道-血液-生殖轴AFB1和球虫联合对绵羊生殖系统的一种新的毒性损伤机制的研究，同时提示调节肠道菌群或干预其代谢物水平可能是一种有潜力的管理绵羊霉菌毒素和球虫联合生殖危害的策略。

作者：

刘凯莉

展开 >

关键词：

绵羊子宫肠道-血液-生殖轴黄曲霉毒素B1 球虫毒性作用

授予学位：

硕士

学科专业：

兽医

导师：

黄淑成

学位年度：

2024

学位授予单位：

河南农业大学

语种：

中文

中图分类号：