摘要
病毒感染和致命病毒性疾病已严重影响人类健康。病毒可以感染几乎所有具有细胞结构的生命体。它们可引起多种疾病，对人类的健康及社会的稳定造成了严重的后果。由于病毒感染的紧迫性和严重性，准确、可靠、快速、易于使用和低成本的检测方法十分必要。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是目前临床上病毒检测的金标准，但是对实验环境要求高，对操作人员要求高，且需要精密的热循环仪，这些条件大大影响了病毒检测的效率。 规律成簇的间隔短回文重复序列（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）自被发现以来，在生命科学领域取得了巨大成就。以CRISPR相关蛋白（CRISPR-associatedprotein，Cas）12和Cas13为代表的CRISPR效应蛋白，由于特有的反式切割活性，已经在病毒检测领域提供了新的方向。但是目前的应用也面临新的挑战，大部分基于CRISPR技术的病毒检测方法都需要大型设备，比如传统基于荧光的CRISPR检测需要荧光定量仪器；基于电化学传感器的CRISPR检测则通过电信号表征结果；基于拉曼散射光谱传感器的CRISPR检测则需要昂贵精密的仪器等等，这些都限制了CRISPR技术在病毒检测中的应用。鉴于目前CRISPR技术的现状及发展趋势，本研究以CRISPR/Cas技术为核心，结合等温扩增技术及基于磁珠的级联放大反应，以纳米金颗粒（Goldnanoparticles，AuNPs）与侧向流试纸条为基础，构建一系列可视化病毒检测方法，用一种更容易读取的信号替代传统的荧光信号。 首先是基于CRISPR/Cas12a的可视化病毒核酸检测的研究（CLAP检测法），以严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2，SARS-CoV-2）为检测对象。本研究整合了逆转录环介导等温扩增（Reversetranscription-loop-mediatedisothermalamplification，RT-LAMP）、CRISPR/Cas12a检测以及功能化AuNPs探针传感器。CRISPR/Cas12a系统识别目标序列，在功能化AuNPs探针传感器的作用下，将目标核酸的诊断结果转换为颜色变化，同时为了进一步提高反应的灵敏度，本研究在CRISPR检测前加入RT-LAMP以实现核酸靶标的指数性放大。从RT-LAMP到CRISPR检测再到可视化信号输出，整个过程等温，不需要精密专业的热循环仪。结果显示，在最佳条件下，此检测法可在40min内检测到4copies/μL的病毒RNA。同时通过质粒转染细胞，提取细胞中的RNA进行检测，考察了此检测法的临床可行性。并且，整个反应可以仅依赖一个金属浴实现，体现了此检测方法即时检测（Point-of-CareTesting，POCT）的可行性。 其次是基于CRISPR/Cas12b的可视化病毒核酸检测的研究（SCAN检测法）。该检测方法整合了RT-LAMP、CRISPR/Cas12b酶切与基于AuNPs探针的可视化检测方法，可在视觉水平和荧光水平上检测SARS-CoV-2的RNA。由于Cas12b具有耐热活性，因此RT-LAMP和Cas12b检测可以集成到一管中反应，即RNA逆转录等温扩增成DNA后即被CRISPRRNA（crRNA）识别，激活Cas12b的酶切活性，整个过程不需要任何额外操作。首先对RT-LAMP与CRISPR/Cas12b集成反应的缓冲液及反应温度进行了优化，结果显示50mMKCl、10mMMgCl2和60℃的反应条件具有最佳性能，接下来分步验证反应的可行性，病毒核酸的检测限可达4copies/μL，然后对集成的一管反应的可行性进行了验证，结果显示，90min时，400copies/μL的病毒RNA即可与空白对照组区分开。由于RT-LAMP与CRISPR/Cas检测集成在一管中，简化了操作过程，避免了多个操作可能造成的核酸污染问题。 接下来是基于CRISPR/Cas12a的无标记可视化病毒核酸检测的研究（LFP检测法），该方法整合了RT-LAMP、CRISPR/Cas12a系统和基于无标记AuNPs的比色系统，用于检测SARS-CoV-2的RNA。首先对无标记AuNPs的比色系统的可行性进行了验证，结果显示一定浓度的ssDNA可以在盐溶液中保护AuNPs，避免聚集，而dsDNA则不行，接下来对无标记比色系统进行了优化，进一步确定反应中的盐浓度及dsDNA浓度，最终确定盐浓度为100mM，DNA浓度为400nM。然后对反应的可行性及灵敏度进行验证，结果显示检测限为4copies/μL的病毒RNA。通过这种方法，目标RNA可被基于智能手机的检测器或肉眼识别，使操作过程更快速、方便，适用于资源有限地区的POCT。由于AuNPs是无标记的，此检测法将比传统的复杂标记或表面功能化化学方法更具成本效益。 最后是建立了一种基于CRISPR/Cas的双酶切系统可视化核酸蛋白同时检测的研究（MCD检测法）。该方法集成了磁分离技术，核酸杂交技术、抗原抗体结合技术、CRISPR/Cas12a体系、CRISPR/Cas13a体系以及侧向流试纸条，最终实现结果的可视化输出。其中磁分离捕获目标分子，一个磁珠上可以结合多个目标分子，每个目标分子再结合一个AuNPs探针，一个AuNPs探针上可结合多个检测DNA/RNA，从而实现信号的级联放大，整个过程在室温进行，通过CRISPR/Cas系统识别检测DNA/RNA，提高反应的特异性，最终通过侧向流试纸条，将检测信号转换为肉眼可见的信号。首先分别单独检测了病毒核酸与蛋白，结果显示，病毒核酸的检测限为1000copies/μL，病毒蛋白的检测限为100fg/mL。接着将核酸检测与蛋白检测集成到一管中，对反应的灵敏度及特异性进行了验证，灵敏度为1000copies/μL病毒核酸与10pg/mL病毒蛋白。 综上所述，本研究开发了四种病毒检测的可视化方法。这四种方法不仅具有高灵敏度，并且可以摆脱对专业操作人员及专业设备的依赖，具有较好的应用前景。
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