摘要
卡巴拉汀是一种可以有效治疗阿尔茨海默症的药物，而N-乙基甲基氨基甲酸-3-[(1S)-羟乙基]-苯基酯（(S)-NEMCA-HEPE）是合成卡巴拉汀途径中的关键手性中间体。目前尚未有报道可以采用化学方法直接合成光学纯(S)-NEMCA-HEPE。仅有几种生物酶法催化合成(S)-NEMCA-HEPE，但都存在需要添加昂贵辅因子、反应时间长、立体选择性差以及污染环境等缺点。本课题组前期构建了醛酮还原酶（yhdN）和葡萄糖脱氢酶（GDH）共表达的重组全细胞用于不对称还原N-乙基-甲基氨甲酰基苯乙酮（NEMCA）制备(S)-NEMCA-HEPE，但仍然存在催化效率低、操作稳定性差等问题。因此，本论文以醛酮还原酶yhdN催化NEMCA不对称还原这一反应进行研究，通过定点及饱和突变改造yhdN的关键氨基酸残基，提高酶的催化活性。并利用全细胞固定化技术，提高全细胞的操作稳定性和重复使用性，使其更适用于生物催化。 为了提高yhdN不对称还原NEMCA的催化性能，将yhdN与底物NEMCA进行分子对接，对结合口袋中除催化四联体外的6个氨基酸位点G19、W21、W28、L87、W126、M323进行丙氨酸扫描，发现突变体G19A可以在40min的反应时间下催化NEMCA不对称还原达到99.0%的转化率及ee值。随后对G19进行了饱和突变筛选，发现突变体G19V和G19C均能达到和G19A同样的催化效果。为了进一步了解反应机制，我们同时对WT、突变体G19A、G19C和G19V进行分子对接，通过对比发现三个突变体均与底物NEMCA分子的苯环形成了新的π?σ相互作用，有助于底物与酶结合的稳定性，同时底物NEMCA的可还原羰基与催化活性中心Y57形成的氢键相互作用，有利于质子转移。因此提高了yhdN突变体不对称还原NEMCA的催化活性。yhdN(G19A)-GDH全细胞在放大50倍条件下时空产率可达到0.89g·L-1·h-1；并且在重复使用六次后依然可以保持60%的催化活性。 为了使yhdN(G19A)-GDH全细胞更具有应用价值，以ZIF-8为载体对全细胞进行固定化研究。ZIF-8固定化全细胞的最佳优化条件为醋酸锌和2-甲基咪唑配比为1:2、磷酸钾缓冲液（pH7.0,100mM）、固定化时间10min、300rpm、固定化全细胞添加量为0.3g。相比于游离全细胞，固定化全细胞的稳定性均有所提高，并且固定化全细胞在重复使用10次后依然能保持50%的催化活性，证明ZIF-8固定化全细胞的方法操作简单，具有很好的应用潜力。 为了进一步提高全细胞的操作稳定性，利用仿生硅载体对全细胞进行固定化研究。仿生硅固定化全细胞的最优固定化条件为CTAB浓度为1mM、磷酸钾缓冲液（pH7.0,100mM）、固定化时间40min。为了提高固定化全细胞的催化活性，将辛基三甲氧基硅烷（octyl-TMS）引入硅层中，发现在TEOS和octyl-TMS比例为1:7的条件下制备的固定化全细胞可以在40min催化NEMCA还原产物转化率99.0%。经过仿生硅层的固定化修饰后，全细胞的稳定性有了明显的提高。并且在重复使用十一次后依然可以保持76.3%的催化活性，表明制备的固定化全细胞在保持活性的同时又可以重复使用，具有应用优势。 综上所述，本论文围绕醛酮还原酶yhdN催化NEMCA不对称还原合成(S)-NEMCA-HEPE这一反应，通过半理性改造提高酶的催化活性。利用固定化技术提高全细胞在生物催化上的操作稳定性以及重复使用性。本论文的研究旨在为(S)-NEMCA-HEPE的合成提供更简便、高效的合成途径，并为其应用提供一定的研究基础。
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