摘要
实验目的： 在遭受下牙槽神经损伤之后，患者可能会经历无法自控的口角流涎、口腔卫生状况恶化、下唇受伤以及进食时的困难，这些症状显著降低了其生活质量。姜黄素通过干预多个细胞内信号传导途径，对坐骨神经的损伤有着修复和保护效果，例如抗氧化作用、抑制炎症反应、缓解脂质过氧化、降低细胞凋亡以及促进髓鞘的再生。自噬是溶酶体介导的细胞质蛋白或细胞器的降解过程，是细胞分化、稳态和生存的基础。在正常细胞中，自噬保持在较低的基础水平，可以被各种环境和细胞应激激活。研究发现周围神经损伤后脊髓背角和脊髓小胶质细胞的自噬激活受损。已知姜黄素可以诱导多种肿瘤细胞类型和血管内皮细胞的自噬。但是，关于姜黄素对下牙槽神经损伤区域和施万细胞自噬的影响知之甚少。本实验通过建立下牙槽神经损伤模型，探究姜黄素是否可以诱导SCs自噬，并作为一种生理途径，促进下牙槽神经损伤后的恢复并研究其相关信号通路。 实验方法： 1.建立大鼠下牙槽神经损伤模型，将36只成年Sprague-Dawley大鼠，随机分为假手术组（Sham组），神经挤压伤组（Crush组），和姜黄素组（Crush+Cur组）。大鼠称重，异氟烷吸入麻醉，利用Crile止血夹钳钳夹神经造成下牙槽神经损伤。在姜黄素处理组中，大鼠通过腹腔注射方式，每日接受100mg/kg的姜黄素治疗。分别于下牙槽神经损伤术后治疗4天和28天后处死大鼠，收集损伤侧下牙槽神经； 2.利用甲苯胺蓝染色技术分析神经纤维的再生数量及再生后髓鞘的情况； 3.通过LFB染色方法观察下牙槽神经髓鞘的恢复状况； 4.用Westernblot和下牙槽神经免疫组织化学染色检测MBP蛋白表达水平和MPZ蛋白表达水平，分别评估下牙槽神经损伤后髓鞘形成情况以及早期髓鞘降解情况； 5.用Westernblot以及Quantitativereal-timePCR鉴定下牙槽神经自噬相关蛋白与髓鞘蛋白及基因的表达情况； 6.利用Westernblot和免疫荧光染色技术，探讨姜黄素如何影响RSC96细胞中自噬相关蛋白的表达及其潜在机制； 7.对大鼠坐骨神经进行半薄切片，用透射电镜分析再生后髓鞘厚度以及损伤后早期自噬小体形成情况。 研究结果： 1.LFB染色结果显示，姜黄素在损伤后的第28天显著增加了神经纤维的再生数量并且提高了髓鞘的厚度。通过甲苯胺蓝染色分析，相较于假手术组，姜黄素处理显著加快了损伤初期的髓鞘降解速度，使得髓鞘结构的降解更为彻底。 2.通过甲苯胺蓝染色分析，相较于假手术组，姜黄素处理显著加快了损伤初期的髓鞘降解速度，使得髓鞘结构的降解更为彻底。此外，与假手术组相比，姜黄素加速了神经损伤后28天髓鞘再生过程，髓鞘结构更完整。 3.Westernblot及免疫组化分析表明，在损伤发生后第四天，接受姜黄素处理的大鼠神经组织中MPZ的水平下降，提示姜黄素加速了髓鞘早期的降解。甲苯胺蓝染色的结果进一步证实了在姜黄素处理组中，髓鞘结构的降解更为彻底。 4.Westernblot结果显示损伤后28天姜黄素组MBP、S100、MAG、PMP22表达升高，免疫组化结果显示MBP蛋白表达升高，说明姜黄素促进了损伤后髓鞘相关蛋白表达，促进髓鞘再生。 5.LFB染色观察显示，在神经损伤组中，髓鞘的数量减少，出现了髓鞘的变性和解体现象；而在姜黄素处理组，观察到髓鞘数量增加，其形态更为规则，厚度更加均匀，边缘清晰，这表明姜黄素的应用有助于促进受损下牙槽神经髓鞘的重建。 6.透射电镜结果显示损伤后4天姜黄素组中双层膜结构的自噬小体数量更多，提示姜黄素可以促进下牙槽神经损伤后早期自噬；透射电镜结果显示损伤后28天姜黄素组中髓鞘结构更完整，数量更多，说明姜黄素可以促进损伤后神经的再生恢复。 7.在姜黄素处理下，大鼠施万细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ水平升高，p62和Beclin-1明显降低，说明姜黄素促进了施万细胞自噬。Akt激动剂明显提高了p62和Beclin-1的表达，姜黄素处理降低了p-Akt的表达，说明Akt与自噬呈负相关。 8.晚期自噬抑制剂CQ与姜黄素一起处理施万细胞，LC3-Ⅱ水平比只使用姜黄素处理组明显升高，p62和Beclin-1则明显降低。说明姜黄素促进施万细胞自噬是通过提高自噬流的作用。 研究结论： 1.通过激活损伤后下牙槽神经内部的早期自噬过程，姜黄素加快了初期髓鞘的降解，进而促进了神经的快速恢复和髓鞘的再生。这一作用机制说明了姜黄素在促进受损神经恢复和髓鞘重建方面的潜在效益。 2.姜黄素可以通过提高自噬流、促进自噬小体的形成促进大鼠施万细胞的自噬。 3.姜黄素可以抑制施旺细胞Akt磷酸化，其促进施万细胞自噬的作用与Akt通路呈负相关。 创新点： 首次证实姜黄素可以通过促进自噬加速下牙槽神经早期髓鞘降解，并能促进损伤后神经髓鞘再生和修复。 证实姜黄素可以提高大鼠施万细胞的自噬，且其促进自噬作用与Akt通路呈负相关。
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