摘要
研究目的: 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位于所有癌症首位。肺腺癌为肺部恶性肿瘤中最为常见的一种类型，占原发性肺癌全部病例数40％左右。以往有研究表明，Tn抗原表达与结直肠癌及乳腺癌等的转移和不良预后有密切联系，但是，Tn抗原表达在肺腺癌发生发展中的具体作用目前还不清楚。本论文旨在探讨异常O-型糖基化导致的Tn抗原表达对人肺腺癌细胞A549、NCI-H1299和H3122的生物学行为的影响及可能的作用机制。 研究方法: (1)通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除人肺腺癌细胞系A549、NCI-H1299和H3122细胞中的T合酶或Cosmc基因，构建稳定表达Tn抗原的人肺腺癌细胞系。使用WesternBlotting方法验证A549、NCI-H1299和H3122细胞中T合酶或Cosmc基因的敲除效率，并通过流式细胞仪检测敲除T合酶或Cosmc基因的人肺腺癌细胞表面Tn抗原的表达率并进行分选，从而获得纯化的Tn抗原阳性表达的人肺腺癌细胞系。 (2)通过Transwell实验及CCK-8实验检测T合酶或Cosmc基因敲除的Tn抗原表达对人肺腺癌细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响。 (3)通过对上皮间质转化(EMT)过程的检测及其调节机制的研究，探讨Tn抗原表达对人肺腺癌细胞转移能力影响的可能机制。 (4)通过WesternBlotting实验检测敲除T合酶或Cosmc基因的Tn抗原表达阳性的人肺腺癌细胞系对podoplanin的影响。 (5)通过CRISPR/Cas9技术对表达Tn抗原阳性的人肺腺癌细胞A549与H1299进行podoplanin过表达;应用WesternBlotting方法检测podoplanin在Tn抗原表达阳性的人肺腺癌细胞中的过表达效率;利用Transwell实验检测podoplanin过表达对于表达Tn抗原阳性的人肺腺癌细胞A549与NCI-H1299的迁移能力的影响; (6)通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除人肺腺癌细胞系A549、NCI-H1299和H3122细胞中的podoplanin基因，使用WesternBlotting方法验证A549、NCI-H1299和H3122细胞中podoplanin基因的敲除效率，并通过Transwell实验检测敲除podoplanin对人肺腺癌细胞迁移能力的影响。 研究结果: (1)通过CRISPR/Cas9技术成功敲除了人肺腺癌细胞的T合酶或Cosmc基因，并通过流式细胞仪检测敲除T合酶或Cosmc基因的人肺腺癌细胞表面Tn抗原异常表达，进一步通过流式分选得到纯化的Tn抗原表达阳性的人肺腺癌细胞系。 (2)Tn抗原阳性表达会明显抑制肺腺癌细胞的迁移与侵袭能力;但对肺腺癌细胞的增殖能力没有明显影响。 (3)WesternBlotting结果显示，Tn抗原表达对EMT通路无明显的调控作用。 (4)WesternBlotting结果显示，podoplanin在Tn抗原表达的人肺腺癌细胞中表达下调。 (5)对表达Tn抗原的人肺腺癌细胞进行podoplanin过表达，并且Transwell结果显示podoplanin的过表达促进Tn抗原表达阳性的肺腺癌细胞的迁移能力。 (6)成功敲除人肺腺癌细胞的podoplanin基因，并且通过Transwell实验发现podoplanin的敲除抑制A549、H1299及H3122细胞的迁移能力。 研究结论: （1）T合酶或Cosmc基因缺失均可诱导Tn抗原异常表达，并且能够抑制人肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。 （2）Podoplanin基因在Tn抗原表达阳性的人肺腺癌细胞中的水平下调，podoplanin过表达能够促进Tn抗原表达阳性的肺腺癌细胞的迁移。 （3）Podoplanin的敲除抑制人肺腺癌细胞的迁移能力，与Tn+表达的肺腺癌细胞的影响一致，提示Tn抗原通过影响podoplanin的表达从而对肺腺癌有抑癌作用。
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