摘要
研究背景 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，也是女性癌症相关死亡的主要原因。放射治疗在宫颈癌的综合治疗中占有重要的地位，放射抵抗却极大地限制了放射治疗的疗效，导致肿瘤未控，提高放射治疗的剂量才能更好的控制肿瘤。但是过高的辐射剂量会对邻近的正常组织造成放射性损伤。目前，以顺铂为基础的化疗药物一直是放射治疗常用的增敏剂。然而，化疗药物相关不良反应限制了其应用范围。研究表明在放射抵抗的肿瘤细胞中观察到铁死亡敏感性的上调，铁死亡是一种新型氧化还原相关的程序性细胞死亡形式，依赖于铁和活性氧诱导的脂质过氧化。随着纳米技术的发展，金属纳米材料在各个研究领域引起了越来越多的关注，被认为是具有广泛生物医学应用前景的材料，尤其在肿瘤放疗增敏领域。金纳米材料具有高原子序数元素材料的特点，有很强的X射线或伽马射线衰减能力，这一特性使其能够作为放疗增敏剂，有效地在肿瘤中沉积辐射能量，提高放射治疗的疗效。此外，铁基纳米材料可通过芬顿反应诱导化学动力学治疗，化学动力学治疗也可与放射治疗联合进行协同治疗。根据肿瘤细胞内源性H2O2特征性过表达和芬顿反应理论，铁与H2O2反应生成的活性氧极易与膜结构上的多不饱和脂肪酸发生抽氢反应，引发自由基链式反应，导致脂质过氧化、膜破裂甚至铁死亡。因此，借助于纳米材料的优异性能，能够通过肿瘤细胞铁死亡增敏放射治疗，这将具有重要临床应用价值。 研究目的 本研究计划构建一种能够同时具备增加细胞内辐射能量沉积、积累氧化物质、抑制肿瘤细胞内抗氧化系统功能为一体的多功能放疗增敏剂-Au/FeNDs，对Au/FeNDs的理化性质和生物学特性进行调控使其满足临床增敏宫颈癌放射治疗的需求；并探索Au/FeNDs在增敏宫颈癌放射治疗中的作用及相关机制，为实现放疗增敏、减轻放射性损伤以及改善患者预后提供理论依据。 研究方法 基于目前的研究现状，本研究以表面部分巯基化的聚乙烯亚胺（SH-PEI）为配体，通过一步法合成了具有超小尺寸的Au/FeNDs；通过透射电镜、动态光散射、能量色散X射线光谱和X射线光电子能谱对合成的Au/FeNDs进行表征；利用电子自旋共振光谱以及紫外-可见分光光谱对Au/FeNDs的?OH生成能力及GSH消耗能力进行检测。CCK-8法测定正常细胞及肿瘤细胞对Au/FeNDs的反应性；在Au/FeNDs联合X-ray应用后，通过克隆形成法评价肿瘤细胞的增殖能力，利用免疫荧光染色观察肿瘤细胞DNA损伤及修复情况，利用流式细胞术检测细胞周期阻滞状态，通过活细胞荧光染色法及流式细胞术对肿瘤细胞活性氧生成情况、对线粒体膜电位的影响以及对肿瘤细胞脂质过氧化的水平进行评估，通过分光光度计法检测肿瘤细胞内铁、谷胱甘肽和丙二醛的含量，通过WesternBlotting法检测细胞周期相关蛋白（CyclinB1和CDK1）、铁死亡相关蛋白（PTGS2、ACSL4、SLC7A1和GPX4）以及PI3K-AKT-Nrf2信号通路的变化。最后，通过建立小鼠皮下肿瘤模型，记录小鼠照射后14天内肿瘤体积及体重的变化；提取荷瘤组织，进行Hamp;E及免疫组织化学染色，检测肿瘤细胞增殖及铁死亡相关蛋白的表达，在整体水平探究Au/FeNDs增敏放射治疗的机制；提取心、肝、脾、肺和肾等正常组织，采用Hamp;E染色进一步评价Au/FeNDs的生物相容性。 研究结果 1.Au/FeNDs优异的理化性质赋予其增敏放射治疗的潜力。 透射电镜、动态光散射、能量色散X射线光谱和X射线光电子能谱分析，证实了Au/FeNDs的表面结构、元素组成及各元素价态；电子自旋共振光谱及紫外-可见分光光谱证实了Au/FeNDs具有良好的催化?OH生成及消耗GSH的能力。 2.Au/FeNDs能够增敏宫颈癌的放射治疗。 CCK-8法测定细胞的存活率表明Au/FeNDs具有良好的生物相容性及肿瘤细胞特异杀伤性质；克隆形成实验表明Au/FeNDs联合X-ray能够抑制U14细胞的增殖能力（Plt;0.05）；免疫荧光实验表明Au/FeNDs联合X-ray能够增加DNA损伤形成的同时抑制DNA损伤的修复（Plt;0.05），从而增加了对肿瘤细胞的杀伤；流式细胞术实验表明Au/FeNDs联合X-ray能够使更多的肿瘤细胞阻滞在放射治疗相对敏感的G2/M期中（Plt;0.001）；WesternBlotting实验表明Au/FeNDs联合X-ray能够下调CyclinB1和CDK1蛋白的表达（Plt;0.01），诱导肿瘤细胞G2/M期阻滞。 3.Au/FeNDs联合X-ray通过促进氧化性损伤及铁死亡的途径增敏放射治疗。 原位荧光成像、GSH及铁离子测定实验表明Au/FeNDs联合X-ray能够增加细胞内活性氧水平（Plt;0.001）、降低线粒体膜电位（Plt;0.001）、促进脂质过氧化的产生和积累（Plt;0.001）、消耗细胞内GSH含量（Plt;0.001）以及增加细胞内可变铁池浓度（Plt;0.001），从而诱导肿瘤细胞铁死亡；WesternBlotting实验证实Au/FeNDs联合X-ray能够上调PTGS2及ACSL4蛋白的表达（Plt;0.001）、下调SLC7A11及GPX4蛋白的表达（Plt;0.001）以及抑制PI3K-AKT-Nrf2信号通路蛋白的表达（Plt;0.001），表明铁死亡在Au/FeNDs介导的放疗增敏中的核心作用。 4.Au/FeNDs对宫颈癌小鼠移植瘤的放疗增敏作用。 在宫颈癌小鼠的移植瘤模型中，CT扫描图像可见Au/FeNDs具有优异的成像效果，能够准确定位肿瘤，避免对正常组织的放射性损伤，实现肿瘤的精准放疗。通过测量小鼠肿瘤的大小及所绘制的肿瘤生长曲线，证明Au/FeNDs联合X-ray治疗对肿瘤生长具有明显的抑制作用（Plt;0.001），在整体水平上证实了Au/FeNDs有效的增敏放射治疗的性质。随后，通过病理学方法对各组小鼠的肿瘤组织进行Hamp;E及免疫组织化学染色，Hamp;E染色证明Au/FeNDs能够显著增强放射治疗的效果；Ki67的免疫组织化学染色证明经Au/FeNDs和X-ray共同作用后，肿瘤细胞的增殖能力明显减弱（Plt;0.001）；进一步，对铁死亡相关蛋白的免疫组织化学染色，在整体水平上证明了，Au/FeNDs联合X-ray能够上调铁死亡促进蛋白（PTGS2）的表达（Plt;0.001），下调铁死亡防御系统的保护性蛋白（SLC7A11和GPX4）的表达（Plt;0.001），从而，通过肿瘤细胞铁死亡的途径实现了增敏放射治疗的目的。 研究结论 本研究成功构建了一种多功能放疗增敏剂Au/FeNDs，能够促进?OH生成、消耗GSH，通过肿瘤细胞的氧化性损伤及铁死亡增敏宫颈癌的放射治疗；同时，Au/FeNDs也具备优异的CT成像性能。Au/FeNDs作为综合癌症诊断和治疗策略的多功能工具，具有较大的临床应用潜力，这一创新性的联合手段将为提高宫颈癌放射治疗的疗效提供新的思路。
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